ENFERMEDAD HEMOLÍTICA DEL RECIÉN NACIDO POR INCOMPATIBILIDAD MATERNO-FETAL DEL TIPO Rh.
MECANISMO DE ACCIÓN DE LA PROFILAXIS CON ANTICUERPOS POLICLONALES Y SU POSIBLE REEMPLAZO CON ANTICUERPOS MONOCLONALES.
PROFESORES INVITADOS:
Dr. Ramón F. Montaño
Dra. Jaheli Fuenmayor.
El Sistema Sanguíneo Rh Los aloantígenos que conforman el sistema sanguíneo Rh humano residen en un complejo de proteínas que se expresa exclusivamente en la membrana de los glóbulos rojos (GR) [1]. La función de este complejo proteico está aparentemente vinculada con un rol estructural en la membrana eritrocitaria [2], aunque pudiera funcionar además facilitando el transporte de amonio [3], de gases (CO2, O2, NH3, NO) [4] y/o de cationes monovalentes [5] hacia o desde el interior del eritrocito. Desde el punto de vista inmunitario, el sistema aloantigénico Rh es una colección diversa de determinantes antigénicos (epítopos) localizados en dos de las cadenas polipeptídicas componentes del complejo Rh, RhD y RhCE, las cuales son proteínas integrales de membrana no glicosiladas [6], que exhiben un grado apreciable de polimorfismo [7] y han sido identificadas en la nomenclatura CD con la designación CD240 [8]. En este complejo aloantigénico se incluyen las clásicas especificidades antitéticas C/c y E/e, que dependen del alelo de RhCE presente en cada individuo, y D/d que inicialmente se pensó también correspondía a un par de alelos antitéticos pero que en realidad está determinada por la presencia (D) o ausencia (d) de la proteína RhD. Esto último ha permitido la clasificación de los seres humanos en Rh positivo (D; cuando RhD está presente) o Rh negativo (d; cuando RhD está ausente).
Las proteínas RhD y RhCE son codificadas por los genes RHD y RHCE, los cuales tienen un origen común, exhiben una alta homología (96%) y se encuentran ubicados en el cromosoma 1 humano [9]. RhD y RhCE son además muy semejantes en secuencia y estructura [4], y su presencia en la membrana eritrocitaria depende críticamente de la interacción con otra proteína integral de membrana denominada RhAg (CD241), con la que comparten cierto grado de homología. Estos tres polipéptidos forman parte de la “familia proteica Rh” y se unen en la membrana del GR a proteínas Rh-accesorias constituyendo el complejo Rh [10]. Además de las clásicas especificidades antes mencionadas, se han identificado serológicamente al menos 52 variantes antigénicas más dentro del complejo Rh [11], todas relacionadas a RhD o RhCE, constituyéndose así en el sistema de antígenos (Ag) eritrocitarios humano más complejo y polimórfico que se conoce. La carencia de la proteína RhD, aunado a su extenso polimorfismo, la hacen muy inmunogénica para los individuos Rh negativo [Rh(–)], estimándose que hasta un 85-90% de quienes se exponen a un contacto con GR Rh positivo [Rh(+)] desarrollan una respuesta inmunitaria -se “sensibilizan”- produciendo aloanticuerpos anti-RhD, principalmente de los isotipos de inmunoglobulina (Ig) G1 e IgG3 [12]. De esta manera, la mayor contribución a la variedad aloantigénica del complejo la aporta sin duda la proteína RhD.
La inmunodominancia de RhD ha facilitado la producción de anticuerpos monoclonales que reconocen de manera específica un número apreciable de variantes alélicas de la misma [13]. Esto, en conjunto con estudios de genética molecular dirigidos a la caracterización del polimorfismo del gen RHD [14], ha permitido una descripción detallada, aunque aparentemente aún incompleta, de la antigenicidad de la proteína RhD y de las diferentes variantes alélicas presentes en las poblaciones humanas [15]. Es así que hoy día se entiende a lo que clásicamente se ha llamado el “antígeno Rh” (aludiendo a la proteína RhD) como un mosaico antigénico diverso que contiene por lo menos 37 epítopos distintos [16]. De acuerdo a los análisis moleculares realizados, muchos de estos epítopos se solapan, algunos son independientes, pero entre ellos se pueden definir al menos seis “clusters” o agrupaciones [15].
La inmunogenicidad de la proteína RhD tiene además consecuencias desde el punto de vista clínico para la práctica de la medicina transfusional, ya que la administración de sangre o productos sanguíneos (principalmente aquellos que contengan GR) derivados de un donante Rh(+) a un paciente Rh(–) casi invariablemente conducirá a la sensibilización de éste al Ag RhD y a la eventual ocurrencia de reacciones hemolíticas post-transfusionales. Adicionalmente, existen individuos Rh(+) cuya proteína RhD exhibe mutaciones que se traducen en la pérdida de uno o varios determinantes antigénicos (son los llamados RhD parcial o variantes D [17]). Estos individuos son usualmente identificados como Rh(+) al utilizar los reactivos y técnicas de hemoclasificación empleadas rutinariamente en bancos de sangre y laboratorios clínicos, pero al transfundirles sangre “Rh-compatible” de un donante cuya proteína RhD es antigénicamente normal pueden generar una respuesta de anticuerpos anti-RhD dirigida a los epítopos que su proteína RhD no posee. En el ámbito de la obstetricia y perinatología, una madre Rh(–) (o RhD parcial) también se encuentra a riesgo de sensibilización con la proteína RhD si gesta un bebé Rh(+), pudiendo presentarse la ocurrencia de la enfermedad hemolítica del recién nacido por incompatibilidad Rh.
La Enfermedad Hemolítica Del Recién Nacido
La enfermedad hemolítica del recién nacido (EHRN) fue reconocida como un síndrome clínico durante los años 30-40 del siglo pasado [18], aún cuando el primer registro documentado de la misma se remonta a principios del siglo XVII [19]. El cuadro clínico de la EHRN incluye anemia de origen hemolítico, eritroblastosis, Hydrops Fetalis (acumulación excesiva de líquidos en el espacio extravascular) e ictericia, de severidad variable. La etiopatogenia de la EHRN fue sugerida en 1938 [20] y está vinculada a la presencia de anticuerpos maternos en la circulación fetal causantes de la destrucción de los eritrocitos del feto. Estos anticuerpos reconocen aloantígenos paternos, presentes en los GR fetales pero ausentes de la madre [21], y su existencia puede ocurrir de manera “natural”, como en el caso de la EHRN por incompatibilidad materno-fetal en el grupo sanguíneo ABO (EHRN-ABO) [22], o producto de una inmunización o gestación previa, como sucede en el caso de la EHRN por incompatibilidad entre los grupos sanguíneos Rh de la madre y el bebé (EHRN-Rh) [23].
En la EHRN-Rh, la vasta mayoría de los casos ocurre cuando una madre cuyo tipo sanguíneo es Rh(–) gesta un feto Rh(+) y, además, presenta anticuerpos anti-RhD. Como se mencionó, los anticuerpos anti-RhD maternos generalmente pertenecen al grupo de las IgG, por lo cual tienen la facultad de atravesar la placenta y alcanzar la circulación fetal donde se combinan con los eritrocitos fetales y aceleran su destrucción, principalmente en el bazo. Como resultado de esta destrucción acelerada de los hematíes se produce anemia, eritroblastosis y el catabolismo de cantidades excesivas de hemoglobina, lo que conduce a un incremento de los niveles de bilirrubina no conjugada ocasionando ictericia y, en casos severos, neurotoxicidad que puede desembocar en la muerte in utero del feto.
De lo anterior resulta claro que, dado el supuesto de la incompatibilidad de grupo sanguíneo indicada, el evento clave para la ocurrencia de la EHRN-Rh es la producción de anticuerpos anti-RhD tipo IgG por parte de la madre. El evento de sensibilización responsable de la aparición de estos anticuerpos puede ser una hemorragia transplacentaria durante (o al término de) un embarazo Rh(+) previo o a consecuencia de una transfusión sanguínea con GR Rh(+).
Profilaxis de la EHRN-Rh
Desde mediados del siglo XX se conoce que la administración de preparaciones de IgG humana enriquecidas en anticuerpos anti-RhD (a las cuales llamaremos genéricamente “IG Rh”) a individuos Rh(–) cuando éstos son expuestos a GR Rh(+) previene el evento de sensibilización a RhD y la subsecuente producción de anticuerpos anti-RhD [24]. La utilización de IG Rh para prevenir la aloinmunización de madres Rh(–) que se encuentran bajo riesgo de sensibilización a RhD ha resultado tan exitosa que la incidencia de inmunización en embarazos Rh-incompatibles se ha reducido en un 90% (de 14% a 1-2%) en regiones industrializadas del mundo como Norteamérica y Europa y actualmente es una indicación médica rutinaria en estas pacientes. Inicialmente la indicación consistió en la administración por vía intramuscular o endovenosa de 100-300 μg de anti-RhD a toda madre Rh(–) no inmunizada a RhD (si la paciente ya está sensibilizada la administración de IG Rh no es capaz de revertir la inmunización) hasta 72 horas después del parto [25], ya que es el momento cuando la sangre fetal tiene la mayor probabilidad de alcanzar la circulación materna. Posteriormente [26] fue establecido que la administración ante-parto (a las 28 semanas de embarazo) puede reducir aún más (hasta 0,1-0,2%) el chance de sensibilización (debida ésta a hemorragias transplacentarias ocultas que pudieran ocurrir durante el embarazo), por lo que cada vez es más común el uso de IG Rh ante-parto, además de la administración post-parto. El problema con la indicación ante-parto, a diferencia de la post-parto, es que para el momento de la administración de la IG Rh usualmente se desconoce si el feto es Rh(+) o Rh(–), de manera que en la práctica hay que colocar el material a todas las mujeres Rh(–) gestantes. Esto hace que en un porcentaje apreciable de casos -aquellos en los que el feto es RhD(–)- la IG Rh se utilice sin necesidad. Recientemente, se ha explorado la posibilidad de realizar la genotipificación RHD fetal utilizando el plasma de la madre, con resultados alentadores [26].
La materia prima utilizada para la preparación de IG Rh es una mezcla de plasmas humanos obtenidos mediante plasmaféresis de donantes inmunizados a RhD que poseen altos títulos de aloanticuerpos específicos. En el pasado los donantes solían ser mujeres Rh(–) sensibilizadas durante un embarazo Rh(+) y que ya no se encontraban en edad reproductiva, pero paradójicamente este tipo de donantes ahora es escaso debido al éxito de los programas de prevención a la aloinmunización a Rh con IG Rh. En su lugar en la actualidad se utilizan hombres Rh(–), quienes voluntariamente acceden a ser inmunizados y luego estimulados repetidas veces con GR Rh(+). Las mezclas de plasma son procesadas industrialmente de manera similar (fraccionamiento mediante precipitación con etanol frío) a como se prepara la inmunoglobulina endovenosa (IVIG) o mediante cromatografía de intercambio aniónico para rendir un producto final que contiene esencialmente IgG humana (principalmente IgG1 y en menor proporción IgG3). Solo una pequeña fracción del total de proteínas presente en una dosis de IG Rh profiláctico corresponde a anticuerpos anti-RhD (entre 50 y 300 μg de anticuerpo versus 50-60 mg de proteína total, dependiendo de la formulación). La naturaleza policlonal de estas preparaciones hace suponer que deben contener una mezcla de anticuerpos anti-RhD con especificidad por la mayoría (sino la totalidad) de los epítopos B (determinantes antigénicos reconocibles por los linfocitos B humanos) contenidos en la proteína RhD, aunque no hay estudios sistemáticos que hayan confirmado esta suposición.
Mecanismo de acción de la IG Rh
La administración conjunta de GR Rh(+) (ABO-compatibles) e IG Rh a individuos Rh(–) ocasiona una rápida desaparición de los GR alogénicos de la circulación [27]. Algo similar sucede si los GR Rh(+) son recubiertos con IgG anti-RhD ex vivo y luego son inyectados [24]. El órgano en el cual ocurre el secuestro de los GR alogénicos recubiertos de anti-RhD es el bazo [28]. Contrariamente, cuando la inyección de estos GR alogénicos no se acompaña con la administración de IG Rh, los mismos exhiben una vida media similar a la de los GR autólogos, pudiéndose detectar en la circulación durante meses. En los primeros dos casos un porcentaje elevado (en algunos estudios el 100%) de los individuos resulta “protegido” de sensibilizarse a RhD; en el tercero, entre un 80-90% se inmunizan y comienzan a producir anti-RhD. Estos hallazgos han sido interpretados para proponer que, en el caso de una mujer Rh(–) con un embarazo Rh(+) a la cual se le administró IG Rh, la eliminación de los GR fetales es tan rápida y completa que no da oportunidad para que ocurra contacto alguno entre éstos y los linfocitos B RhD-específicos de la madre, evitando así su activación y posterior diferenciación a células plasmáticas productoras de anticuerpos anti-RhD, lográndose entonces el efecto profiláctico. Esto es lo que en la literatura angloamericana se conoce con el nombre de “antigen (RBC) clearance hypothesis”, es decir, “hipótesis de eliminación del antígeno” [29].
Aún cuando la hipótesis de eliminación del antígeno resulta satisfactoria para explicar el efecto preventivo inmediato de la IG Rh, no lo es para explicar el carácter “residual” o prolongado de su acción profiláctica. En varios estudios se ha documentado que si se deja transcurrir el tiempo suficiente (hasta 10 meses) para que desaparezca (o al menos no sea detectable) la IgG anti-RhD de la circulación de los individuos Rh(–) en los que la administración de IG Rh produjo un efecto profiláctico, un número de individuos bastante menor al esperado resulta inmunizado al repetir la inyección de GR Rh(+) en ausencia de una nueva dosis de IG Rh [30]. Ello ha dado lugar a la formulación de otras teorías que toman en cuenta esta observación. La que mayor aceptación ha tenido -hasta hace relativamente poco tiempo- se fundamenta en un fenómeno experimental denominado Inmunosupresión Mediada por Anticuerpos (AMIS, del inglés “Antibody-Mediated Immune Suppression”), en el cual la administración a conejos [31], ratones [32], y otras especies animales [33] de un Ag -en la forma de complejo inmune (CI) con anticuerpos tipo IgG- conduce a la supresión de la respuesta humoral específica en contra del Ag administrado. La explicación que se ha dado a la AMIS es que cuando el Ag -en la forma de CI- interactúa con la célula B a través del BCR (receptor para el antígeno en la célula B), también lo hace a través de un receptor Fc gamma (FcγR, del inglés “Fc gamma receptor”) que está presente en la membrana de la célula B denominado FcγR2B. FcγR2B es un receptor inhibitorio (posee motivos ITIM en su porción intracelular [34]), de baja afinidad, que se une a la porción Fc de la IgG sólo cuando ésta forma CI con el Ag. Esta situación de coligamiento a través del BCR y del FcγR2B envía dos señales al interior de la célula B virgen, una positiva (vía BCR) y otra negativa (vía FcγR2B), que son “interpretadas” conjuntamente como un mensaje de regulación (arresto celular), en lugar de activación, y que la conducen a un estado de anergia [35]. Adicionalmente, la agregación del FcγR2B en la membrana de la célula B estimula la generación de señales proapoptóticas [35]. De esta manera, las clonas de células B Ag-específicas se mostrarían “tolerantes” (escenario de anergia) y/o estarían ausentes (escenario de la apoptosis) cuando se hace la segunda administración del Ag.
El mecanismo de AMIS pareciera adecuado para explicar la acción profiláctica (tanto inmediata como residual) de la IG Rh. No obstante, estudios recientes realizados en ratones nocaut para el receptor FcγR2B (mutantes que no expresan el receptor) han arrojado una sombra de duda acerca de que éste sea realmente el mecanismo por el cual opera la IG Rh en la prevención de la aloinmunización a la proteína RhD. En estos estudios se puso en evidencia que el fenómeno de AMIS ocurre en los ratones FcγR2B-nocaut de manera normal y similar a como se manifiesta en los ratones silvestres [36].
En vista de que ninguno de los mecanismos revisados acá y otros que se han propuesto parecen explicar de manera satisfactoria la acción profiláctica de la IG Rh [37], es pertinente proponer una explicación diferente que, por supuesto, tome en cuenta tanto el carácter inmediato como el efecto residual de la IG Rh. En este sentido y en atención a los antecedentes examinados, nos ha parecido atractivo sugerir un mecanismo alternativo: que la IG Rh pudiera operar provocando en la madre un asincronismo entre la respuesta humoral y celular en contra del antígeno RhD y es esta la causa de la acción profiláctica. Expliquémonos con un poco más de detalle.
En primer lugar sostengamos que, efectivamente, cuando se administra IG Rh a un individuo Rh(–) y en su circulación hay GR Rh(+), ocurre un secuestro rápido y eficaz de estos GR alogénicos por el sistema retículo-endotelial esplénico. In vitro, la unión de IgG anti-RhD al GR Rh(+) no conduce a activación del complemento [38] ni a hemólisis; más aún, tampoco es capaz de inducir hemaglutinación, lo cual ha sido atribuido a la relativamente baja densidad y a la poca exposición de la proteína RhD en la superficie del GR [27]. De esta manera, el secuestro y posterior eliminación de los GR Rh(+) sensibilizados con anti-RhD en el bazo probablemente no implique el concurso del sistema del complemento. De acuerdo con esto, los GR alogénicos probablemente viajen en la circulación materna e ingresen al parénquima esplénico, a la pulpa roja más concretamente, confundidos entre los GR autólogos pero recubiertos de moléculas de IgG anti-RhD. El retorno de la sangre desde la pulpa roja a la circulación implica un proceso de filtración a través de un endotelio especializado que reviste los senos venosos [39]. En este endotelio abundan células del sistema retículo-endotelial (macrófagos esplénicos), lo que permitiría entonces la interacción de los “complejos inmunes” -GR Rh(+) : IgG anti-RhD- con estos macrófagos esplénicos y su subsiguiente retención rápida y selectiva. Esto impediría la ocurrencia de contactos productivos entre los linfocitos B RhD-específicos y los GR Rh(+), evitándose la activación de estos linfocitos. La IG Rh estaría actuando entonces como lo postula la “hipótesis de eliminación del antígeno” e impidiendo la estimulación del componente humoral de la respuesta inmunitaria anti-RhD. Pero ¿Cuál es el destino de los GR alogénicos que interactúan con el sistema retículo-endotelial esplénico? ¿Cuál(es) mecanismo(s) opera(n) para su destrucción?
Continuando en este orden de ideas, los dos mecanismos principales de eliminación deberían ser la fagocitosis inmune y/o la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC, del inglés “Antibody-Dependent Celular Cytotoxicity”), ambos supeditados a la unión de la porción Fcγ de los anticuerpos anti-RhD con receptores FcγR en la superficie de las células efectoras. El consenso en la literatura es que ambos mecanismos actúan, aunque no existen evidencias experimentales directas para apoyar esta suposición. Haciendo un ejercicio teórico, uno podría imaginar una condición “extrema” en la cual hay numerosas moléculas de IgG anti-RhD sobre la superficie de cada GR Rh(+), en cantidad suficiente como para inducir a través de su porción Fc el agrupamiento de los receptores FcγR en la membrana de la célula efectora y así fomentar la eritrofagocitosis de manera preferencial por sobre la ADCC. En este escenario toda la carga antigénica RhD estaría inmediatamente disponible para la maquinaria de procesamiento del fagocito y su posterior presentación en el contexto de moléculas HLA clase II a clonas de linfocitos T cooperadores (Th) cuyo TCR (receptor para el antígeno en la célula T) muestre especificidad por péptidos derivados de la proteína RhD. El “extremo” opuesto sería la situación en la cual cada GR Rh(+) tiene moléculas de IgG anti-RhD unidas, pero no en la cantidad suficiente para estimular la fagocitosis aunque sí capaces de mediar la unión del GR a la célula efectora y posteriormente el fenómeno de ADCC. En este escenario, el estroma de los GR lisados podría mantenerse unido a la membrana de la célula efectora, pero no estaría disponible para el procesamiento y presentación. Aunque nosotros nos inclinamos a suponer que el destino final del estroma es la fagocitosis, ello constituye una incógnita puesto que no hay estudios que le den soporte a tal suposición. Continuando el ejercicio teórico, se podría además concebir un sinnúmero de situaciones intermedias entre estos dos extremos, en las que probablemente ocurrirían ambos procesos.
En cualquier caso es muy probable que, luego de la rápida captura de los GR alogénicos en el bazo, haya procesamiento y presentación antigénica a linfocitos Th RhD-específicos. Si esto es así, la respuesta celular anti-RhD sería estimulada y deberían expandirse clonas de linfocitos Th RhD-reactivos. Evidencia experimental reciente, obtenida mediante el examen de la respuesta proliferativa de células mononucleares de sangre periférica de individuos Rh(–) inmunizados con GR Rh(+) cuando son estimuladas in vitro con péptidos sintéticos de la proteína RhD, apunta a que ello en realidad está ocurriendo en estos sujetos [40]. Bajo tales condiciones, al no haber linfocitos B RhD-específicos que se encuentren experimentando estimulación a través de su BCR, las células Th RhD-específicas no tendrían a quien ayudar ¿Qué le sucede a estas clonas “huérfanas” de linfocitos Th RhD-específicos? La respuesta a esta pregunta podría ser clave para un mejor entendimiento del mecanismo de acción profiláctica residual de la IG Rh. Si estas clonas de linfocitos Th se agotan en el tiempo, cuando se realice la administración de GR Rh(+) por segunda vez (de 06 a 10 meses después y en ausencia de IG Rh), se podría dar la situación inversa; esto es, hay una adecuada estimulación de la respuesta humoral (los linfocitos B RhD-específicos tienen ahora el tiempo suficiente y la disponibilidad antigénica en la superficie del GR alogénico para garantizar encuentros efectivos y estimulantes) pero las clonas de linfocitos Th RhD-específicos ya no están presentes para cooperar. El resultado en este escenario sería que, nuevamente pero por razones distintas, la sensibilización “humoral” a la proteína RhD no ocurre, y estaría operando el efecto profiláctico inmediato y residual de la IG Rh, debido a la inducción de un asincronismo entre las respuestas humoral y celular de la madre.
La comprobación experimental de la hipótesis del asincronismo entre las respuestas humoral y celular pudiera resultar algo complicada de justificar y de realizar en humanos. Ello implicaría el concurso de voluntarios Rh(–) a los que se inyecten GR Rh(+) o mujeres Rh(–) con embarazos Rh(+), a quienes luego de la administración de IG Rh se les tendría que tomar muestras de sangre seriadas en el tiempo para estudiar la producción de anticuerpos y células Th anti-RhD, para luego readministrar GR Rh(+) -en el caso de los voluntarios- o aguardar por un segundo embarazo Rh(+) -en el caso de las madres- y repetir el análisis. Sin embargo, la reciente disponibilidad de un modelo de ratones transgénicos que expresan la proteína HEL (lisozima de huevo de gallina) de manera exclusiva en sus GR [41] ha creado, por vez primera, un grupo sanguíneo en el ratón de laboratorio, facilitando la posibilidad de estudiar el efecto profiláctico de una IgG específica contra un “aloantígeno” de GR en este modelo.
Ahora bien, el lector podrá preguntarse: si la IG Rh funciona tan espléndidamente previniendo la aloinmunización a RhD y es un producto seguro, que ha mostrado no tener efectos colaterales mayores y una eficacia que ha sido demostrada durante ya más de 40 años de continua administración en cientos de miles de mujeres embarazadas ¿Por qué molestarse en encontrarle una explicación a su acción profiláctica? La respuesta es sencilla y tiene dos vertientes. En primer lugar, tal vez desde un punto de vista práctico esta actitud pragmática sea correcta. Sin embargo, desde el punto de vista académico-científico no lo es. La curiosidad por conocer las intimidades de cómo estas moléculas actúan para resultarnos tan útiles en la vida cotidiana y la esperanza de que en ese conocimiento pudieran encontrarse respuestas a cómo opera el sistema inmunitario humano en otros contextos es justificación más que suficiente. En segundo lugar, y tal vez más importante aún, están otros hechos ahora sí de orden práctico: con la indicación de la IG Rh anteparto (referida al inicio de este texto) y el crecimiento poblacional, la demanda de IG Rh va en aumento. Lo anterior se enfrenta al hecho de que, por razones de índole ética y vinculadas a riesgos de transmisión de agentes infecciosos [42], la disponibilidad de las mezclas de plasma hiperinmune (que es la materia prima a partir de la cual se prepara la IG Rh) se ve cada día más comprometida. Estas razones empujan con fuerza a la comunidad científica y médica hacia la búsqueda de una alternativa a la IG Rh. No cabe duda que el camino cierto para encontrarle reemplazo a la IG Rh debe pasar por un entendimiento cabal del mecanismo a través del cual actúa.
Anticuerpos monoclonales anti-RhD como posible reemplazo de la IG Rh
Una de las opciones que más se ha considerado como posible reemplazo de la IG Rh son los anticuerpos monoclonales (MAb) anti-RhD. Los intentos iniciales para producir MAb anti-RhD fueron realizados a partir de hibridomas de ratón y resultaron un fracaso ya que el sistema inmunitario del ratón de laboratorio produce una respuesta humoral anti-Rh que no distingue los determinantes antigénicos D de los CE. Sin embargo, actualmente se dispone de numerosas clonas de células productoras de MAb anti-RhD de origen humano. La vasta mayoría de estos MAb humanos (huMAb) fueron producidos utilizando variaciones de la tecnología desarrollada inicialmente por Kohler y Milstein [43], o a través de la producción de líneas de células linfoblastoides humanas generadas mediante transformación con el virus Epstein-Barr [44], lo cual en esencia implica la “inmortalización” y clonación de las células productoras del anticuerpo. Más recientemente, un número menor de huMAb anti-Rh se ha desarrollado mediante la aplicación de técnicas de biología molecular y ADN recombinante [45], en las que lo que se persigue es la clonación e “inmortalización” de los genes que codifican estas proteínas. Un número apreciable de estos huMAb anti-RhD han sido caracterizados in vitro en cuanto a su especificidad por los distintos epítopos RhD [13] y en su habilidad para mediar funciones efectoras como la fagocitosis y ADCC [46]. Unos pocos han sido probados en estudios experimentales realizados en voluntarios Rh(–) con el propósito de calcular su vida media in vivo, evaluar su capacidad para mediar la eliminación acelerada de GR Rh(+) y estimar sus bondades como agentes profilácticos en la prevención de la aloinmunización a la proteína RhD, todo ello con el fin último de compararlos con las preparaciones policlonales de IG Rh disponibles hoy en día [47].
Si bien es cierto que los trabajos iniciales de caracterización in vitro de los huMAb anti-RhD suscitaron gran expectativa acerca de la posible formulación de un reactivo monoclonal que sustituyera a las preparaciones de IG Rh usadas en la actualidad, los resultados de los estudios in vivo no han sido tan alentadores. Efectivamente, a partir de los estudios in vitro utilizando GR Rh(+) que expresan formas mutadas de RhD -tales como las variantes D a las que se hizo referencia al inicio del texto, y otras- ha quedado claro que se dispone de huMAb anti-RhD que reconocen una mayoría importante de los diferentes epítopos RhD presentes en las poblaciones humanas [13, 16]. Por otro lado, los estudios in vitro también han permitido la identificación de huMAb anti-RhD que se comportan en ensayos funcionales de fagocitosis y ADCC tan eficazmente -en algunos casos mejor- que las preparaciones policlonales [48]. Este tipo de ensayos ha permitido además un examen detallado y por separado de las bondades de los isotipos IgG1 e IgG3 anti-RhD -que son los 2 isotipos presentes en la IG Rh- para facilitar la unión de los GR Rh(+) a células efectoras, así como también para mediar la fagocitosis y la ADCC [46, 49]. Más aun, gracias al uso de técnicas de mutagénesis sitio-dirigida y otras de biología molecular, se han desarrollado formas alteradas de estos anticuerpos. Por ejemplo, algunos poseen modificaciones en la secuencia de amino ácidos correspondiente a lugares específicos en la porción Fc de la molécula, lográndose variantes que no muestran afinidad alguna por los receptores FcγR [50] pero preservan la capacidad de unión al receptor FcRn [51] y con ello mantienen la propiedad de ser transportados a través de la placenta. Otros son anticuerpos tipo IgG que polimerizan en una forma similar a como lo hace la IgM y adquieren ahora la habilidad de mediar la aglutinación directa de los GR Rh(+) [52].
Desgraciadamente, a pesar de todos estos esfuerzos no ha sido posible formular una alternativa monoclonal a la IG Rh. Los resultados de los estudios in vivo y el estado actual del desarrollo de los monoclonales anti-RhD para fines profilácticos son un claro testimonio de ello. En primer lugar, hay que decir que el número de huMAb anti-RhD que han sido probados in vivo (19 anticuerpos, de acuerdo a la literatura consultada) parece discreto si se compara con la cantidad que ha sido producida (más de 100 anticuerpos que han sido estudiados sistemáticamente, de acuerdo al más reciente “workshop” de la ISBT [13]). Con estos 19 anticuerpos se han realizado 14 estudios in vivo [50, 53-65], pero solo 11 fueron evaluados en términos de su capacidad profiláctica. La variabilidad de los resultados obtenidos no pudo ser mayor. Solo 2 de los 11 anticuerpos se comportaron igual o mejor que las preparaciones policlonales previniendo la aloinmunización a RhD [58, 59], algunos incluso produjeron un incremento en el número de individuos inmunizados [56] y en los otros casos el número de individuos que resultó protegido fue bastante menor a lo observado con las preparaciones policlonales utilizadas como control [53-55, 57]. El precario desempeño de los huMAb anti-RhD como agentes profilácticos de la aloinmunización a RhD ha dado lugar a la elaboración de una variedad de posibles explicaciones, ninguna de las cuales ha sido definitivamente confirmada o refutada experimentalmente [47, 56, 66].
En nuestra opinión, un aspecto al que no se ha prestado suficiente atención y que pudiera ser importante para explicar las diferencias entre la IG Rh y los huMAb anti-RhD es el carácter monoespecífico de estos últimos versus la naturaleza poliespecífica de las preparaciones de IG Rh. ¿Por qué esto pudiera ser importante? La IG Rh está compuesta por una población de moléculas de IgG anti-RhD heterogénea en cuanto a su especificidad por los distintos epítopos de la proteína RhD, brindando la oportunidad de que a cada molécula RhD en la membrana eritrocitaria se puedan unir más de una molécula de IgG anti-RhD. En el caso de los huMAb anti-RhD esto no es posible; por cada molécula RhD, el número máximo de moléculas de anticuerpo que se puede unir es una. La relativa poca movilidad [67] y baja densidad [23] del complejo Rh en la membrana eritrocitaria (se ha calculado que existan entre 10.000 a 30.000 complejos Rh que contienen proteína RhD por GR, dependiendo del fenotipo) podría hacer que esta diferencia sea crucial en cuanto a facilitar el proceso de eritrofagocitosis por parte de la IG Rh en comparación con los huMAb anti-RhD. En otras palabras, al haber solo una molécula de anticuerpo unida por complejo Rh en el caso de los huMoAb anti-RhD, esto pudiera traducirse en una mediación menos eficiente de la fagocitosis y ello conducir a una menor capacidad para facilitar el secuestro rápido de los eritrocitos alogénicos en el bazo, lo cual es considerado el mejor indicador de la acción profiláctica de los anticuerpos anti-RhD. Nosotros hemos producido y comparado en ensayos de fagocitosis in vitro [68] versiones monoméricas y poliméricas de una IgG recombinante anti-RhG (RhG representa un epítopo que es común a las proteínas RhD y uno de los alelos de RhCE). En las versiones monoméricas, cada molécula de IgG posee solo una porción Fc, mientras que en las versiones poliméricas cada molécula tiene un mínimo de 2 hasta un máximo de 5-6 porciones Fc por molécula. Los GR Rh(+) opsonizados con los anticuerpos monoméricos fueron discretamente fagocitados por macrófagos aislados de la cavidad peritoneal de ratones de laboratorio, mientras que el 100% de los GR opsonizados con las versiones poliméricas de anti-Rh (a una concentración no aglutinante) resultaron fagocitados. De manera interesante, en estos estudios no se apreciaron diferencias en cuanto a la incapacidad manifiesta de las formas poliméricas y monoméricas de los anticuerpos anti-RhG para activar el complemento.
Si las consideraciones anteriores son correctas, probablemente será necesario utilizar una mezcla de monoclonales con especificidad por epítopos RhD diferentes e independientes o emplear versiones recombinantes poliméricas de anti-RhD para lograr una formulación monoclonal que tenga las propiedades profilácticas de la IG Rh. Es la impresión de los autores que en la actualidad se dispone del material monoclonal y de información y conocimiento suficiente para, utilizado de la manera adecuada, poder formular una mezcla de huMAb anti-RhD con propiedades profilácticas de la aloinmunización a RhD similares a las que exhibe la IG Rh.
Agradecimientos:
Los autores agradecen a los Dres. Egidio Romano, Andrés Soyano y Graciela León por los comentarios y sugerencias realizados al manuscrito.
ACERCA DE LOS AUTORES
B) ESTUDIOS REALIZADOS
UNIVERSIDAD: Universidad Católica Andrés Bello (UCAB).
Título: Licenciado en Educación, mención Ciencias Biológicas
Año de graduación: 1984
POST GRADO:
a) Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC)
Título: M.Sc. (Master) en Biología, mención Inmunología.
Año de graduación: 1988.
b) Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC) Título: Ph.Sc. (Doctor) en Biología, mención Inmunología.
Año de graduación: 1996.
c) Hipple Cancer Research Center, Pasantía postdoctoral
Año: Enero, 1996 - Septiembre, 1996.
d) University of California, Los Angeles, Molecular Biology Institute
Pasantía postdoctoral.
Año: Septiembre, 1996 - Diciembre, 1998.
OTROS CURSOS:
Becton Dickinson Training Center
BD Biosciences FACSCaliburTM Training Course.
Año: Ago. 2000.
C) CARGOS DESEMPEÑADOS
1- Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC)
Desde 1999 hasta el presente.
Investigador Asociado III adscrito al laboratorio de Patología Celular y Molecular, Centro de Medicina Experimental.
2- University of California, Los Angeles (UCLA) Molecular Biology Institute. California, EUA.
Desde Agosto 1996 hasta Diciembre 1998.
"Postdoctoral Fellow”.
3- Hipple Cancer Research Center. Dayton, Ohio. EUA.
Desde Enero 1996 hasta Julio 1996.
“Postdoctoral Fellow”.
4- Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC),
Desde Junio 1988 hasta junio 1995.
Profesional Asociado a la Investigación (PAI), adscrito al laboratorio de Fisiopatología, Centro de Medicina Experimental.
5- Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC)
Desde 1993 hasta 1995.
Estudiante Graduado de Ph.Sc. (Doctorado). Centro de Estudios Avanzados.
6- Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC)
Desde 1985 hasta 1988.
Estudiante Graduado de M.Sc. (Maestría). Centro de Estudios Avanzados.
7- Universidad Central de Venezuela (UCV)
1984.
Estudiante Visitante, Instituto de Medicina Experimental.
D) BECAS, PREMIOS Y DISTINCIONES
1- Beca otorgada por la Fundación “Gran Mariscal de Ayacucho” (Caracas, Venezuela) para realizar estudios de Post-grado a nivel de maestría (M.Sc./IVIC). 1985-1988.
2- Beca otorgada por el IVIC (Caracas, Venezuela) para realizar estudios de Post-grado a nivel de doctorado (Ph.Sc./IVIC) 1993-1995.
3- Miembro del “Sistema de Promoción al Investigador”, nivel “Candidato”, desde 1993 hasta Julio de 1995; Nivel “Investigador I” desde Julio de 1995; Nivel "Investigador II" desde Enero de 2003
4- Beca otorgada por el Hipple Cancer Research Center (Dayton, Ohio. USA) para realizar estudios postdoctorales. (1996).
5- Premio “Paola Carpi ”, año 1996 (IVIC, Venezuela).
6- Premio “Orinoquia”, año 1996 (Fundacion Orinoquia, Venezuela).
7- Fogarty International Research Fellowship Award; otorgado por el Fogarty International Center/ National Institutes of Health (USA) 1996-1998.
8- Premio AUIP a la calidad del Postgrado y el Doctorado en Iberoamérica 2003 (Mención de Honor); otorgado por la Asociación Universitaria Iberoamericana de Postgrado. Salamanca, España.
9- Premio “AACR/Avon Foundation award, for attending the American Association for Cancer Research Annual Meeting (Abril 2008). San Diego Convention Center. San Diego, USA”.
E) FORMACIÓN DE RECURSOS HUMANOS
Título del Trabajo de Grado: Construcción y caracterización estructural y funcional de proteínas de fusión IgG-IgM con especificidad anti-RhG.
Nombre de la estudiante: Dylana Díaz.
Título obtenido: Doctor en Ciencias, mención Inmunología.
Institución: IVIC
Fecha: 2009
Título del Trabajo de Grado: Fusión molecular de un anticuerpo anti-HER2 a C5a o C5adesArg: Potenciación de su efecto sobre cultivos de células tumorales SKBR-3.
Nombre de la estudiante: Jaheli Fuenmayor.
Título obtenido: Doctor en Ciencias, mención Inmunología.
Institución: IVIC
Fecha: 2007
Título del Trabajo de Grado: Producción y caracterización in vitro de una proteína de fusión CTLA4-Fce.
Nombre de la estudiante: María Auxiliadora Miranda.
Título obtenido: Magíster Scientiarum en Biología, mención Inmunología.
Institución: IVIC
Fecha: 2006
Título del Trabajo de Grado: Diseño y construcción de genes recombinantes codificantes de una proteína de fusión CTLA4-Ig.
Nombre de la estudiante: Nurys Suárez.
Título obtenido: Magíster Scientiarum en Biología, mención Inmunología.
Institución: IVIC
Fecha: 2004
Título de la Tesis de Grado: Polimorfismo genético de citoquinas (TNF-a, IFN-g, IL-6, TGF-b1, IL-10) y de molécula coestimuladora (CTLA-4) y su correlación con los eventos de rechazo en pacientes sometidos a trasplante renal alogénico.
Nombre de la estudiante: Ketevan Gendzekhadze.
Título obtenido: Doctor en Ciencias, mención Inmunología.
Institución: IVIC
Fecha: 2003
OTRAS ACTIVIDADES DOCENTES:
1- Coordinador de Postgrado en el área de Inmunología, Centro de Estudios Avanzados. IVIC. Desde Septiembre 2001 hasta Septiembre 2005.
2- Coordinador de los cursos Seminarios en Inmunología y Técnicas en Inmunología. Centro de Estudios Avanzados, IVIC. Desde 1998.
3- Profesor de los cursos de Inmunología Molecular e Inmunogenética. Centro de Estudios Avanzados, IVIC. Desde 1998.
4- Profesor invitado a cursos de postgrado en la Universidad Central de Venezuela (UCV):
. Maestría en Inmunología Básica del Instituto de Inmunología, Facultad de Medicina.
. Maestría en Medicina Veterinaria de la Facultad de Veterinaria.
. Postgrado de Inmunología Clínica y de Laboratorio, Facultad de Medicina.
5- Profesor invitado a cursos de postgrado en La Universidad del Zulia (LUZ):
. Curso especial "Producción de Anticuerpos Monoclonales", Maestría en Inmunología Básica de la Facultad Experimental de Ciencias. 2004.
. Asignatura Inmunogenética. Noviembre 2005, 2006 y 2007.
6- Profesor invitado a cursos de postgrado en La Universidad de los Andes (ULA):
. Curso “Reacción Antígeno-Anticuerpo. Principios generales y métodos de detección”. Enero 2006, 2007.
7- Tesis y trabajos de grado en progreso:
Tutor de una (1) tesis de grado de doctorado-IVIC; Director de una (1) tesis de grado de doctorado-IVIC.
F) SOCIEDADES PROFESIONALES Y CIENTÍFICAS
1- Miembro de la Asociación Venezolana para el Avance de la Ciencia (ASOVAC).
G) ASISTENCIA Y TRABAJOS PRESENTADOS EN CONGRESOS
1988:
1. MONTAÑO R., Soyano A. y Romano E.
Efecto de la ferritina sobre la blastogénesis de células mononucleares humanas inducida por lectinas o galactosa-oxidasa. (Effect of ferritin on blastogenesis of human mononuclear cells induced by lectins or galactose oxidase). XXXVIII Convención Anual de AsoVAC. (1988). UCV, Maracay, Venezuela.
1990:
2. Romano E., Soyano A., MONTAÑO R., Worsley G., Ratcliffe M. and Olson M.
Treatment of ABO hemolytic disease of the newborn with synthetic A or B blood group trisaccharides. Twenty-Third Congress of the International Society of Hematology. (1990). Boston, MA, USA.
1991:
3. MONTAÑO R., Romano E., Soyano A. y Taylor P.
Ensayo inmunoenzimático para la detección de oligosacáridos sintéticos de uso clínico potencial. II Congreso Venezolano de Hematología. (1991). San Cristóbal, Venezuela.
4. Cariani L., Romano E., Martínez N., MONTAÑO R., Suárez G., Soyano A. y Ruiz I.
Evaluación de la incidencia y de factores que influyen en la severidad de la enfermedad hemolítica del recién nacido de tipo ABO (EHRN-ABO). II Congreso Venezolano de Hematología. (1991). San Cristóbal, Venezuela.
5. Romano E., MONTAÑO R., Soyano A. y Taylor P.
Ensayo inmunoenzimático para la detección de oligosacáridos sintéticos de uso clínico potencial. (Immunoenzymatic assay for the detection of synthetic oligosaccharides of potential clinical use). XLI Convención Anual de AsoVAC. (1991). Maracaibo, Venezuela.
1993:
6. Romano E., Brito B., Cardier J., MONTAÑO R., Bracho M., Parthe V. y Soyano A.
Hierro dextran parenteral induce lesiones tipo ateroescleróticas en aortas de conejos. III Congreso Venezolano de Hematología. (1993). Maracaibo, Venezuela.
7. Romano E., MONTAÑO R., Brito B., Alonso J., Gebrán S., Soyano A. y Apitz R.
Ajoene afecta algunas funciones de linfocitos y macrófagos (Effects of Ajoene on lymphocyte and macrophage function). XLIII Convención Anual de AsoVAC. (1993). Mérida, Venezuela.
8. Romano E., Bracho C., Pérez H., MONTAÑO R., Soyano A. y Suárez G.
Mejoramiento en la observación de parásitos de Malaria en frotis de sangre periférica. (Improvement in the observation of malaria parasites in peripheral blood smears). XLIII Convención Anual de AsoVAC. (1993). Mérida, Venezuela.
9. Romano E., Brito B., Cardier J., MONTAÑO R., Bracho M., Parthe V. y Soyano A.
Induction of atherosclerotic lesions in the aorthas of rabbits by repeated intramuscular administration of iron dextran. Thirty-Fifth Annual Meeting of The American Society of Hematology. St Louis, MO, USA. (1993). Publicación: Ref. 3 and 10.
10. Romano E., Brito B., Cardier J., MONTAÑO R., Bracho M., Parthe V. y Soyano A.
Hierro dextran parenteral induce lesiones tipo ateroescleróticas en aortas de conejos. II Congreso de la Sociedad Latinoamericana de Aterosclerosis. (1993). Caracas, Venezuela.
1994:
11. Romano E., Bracho C., Pérez H., MONTAÑO R., Soyano A. y Suárez G.
Improvement in the observation of malaria parasites in peripheral blood smears. XXV Congress of the International Society of Hematology. (1994). Cancún, México.
12. MONTAÑO R., Romano E.L. y Hughes-Jones N.C.
Producción de anticuerpos monoclonales humanos específicos para el grupo sanguíneo Rh. (Production of human monoclonal antibodies specific for the Rh blood group antigen). XLIV Convención Anual de AsoVAC. (1994). Coro, Venezuela.
13. MONTAÑO R., Romano E.L. y Hughes-Jones N.C.
Presencia del epitopo Gal a(1-3) Gal en anticuerpos monoclonales humanos producidos por heterohibridomas humano-múrido. (Presence of the Gal a(1-3) Gal epitope in human monoclonal antibodies produced by human-mouse heterohybridomas). XLIV Convención Anual de AsoVAC. (1994). Coro, Venezuela.
14. Romano E.L., Araujo J., Brito B., Bracho M.P., Cardier J., Parthe V., y MONTAÑO R.F.
Iron overload augments the formation of atherosclerotic lesions in hypercholesterolemic rabbits. Xth International Symposium on Aterosclerosis. (1994). Montréal, Canadá.
1995:
15. Romano E.L., MONTAÑO R.F.
Human monoclonal anti-Rh antibodies produced by human-mouse heterohybridomas express the Gal a1-3 Gal epitope. Fourth International Conference on Human Antibodies and Hybridomas. (1995). Amsterdam, The Netherlands.
16. MONTAÑO R.F. y Romano E.L.
Gal a1-3 Gal epitope non-expression: an important criterion for the selection of fusion partners to be used in the development of heterohybridomas producing human monoclonal antibodies. The 9th International Congress of Immunology. (1995). San Francisco, CA. USA.
17. MONTAÑO R.F. y Romano E.L.
Caracterización estructural y funcional de anticuerpos monoclonales humanos anti-Rh(D) de uso médico potencial. XLV Convención anual de AsoVAC. U.S.B. (1995). Caracas, Venezuela.
18. Wittig O., Romano E.L. y MONTAÑO R.F.
Producción y caracterización de anticuerpos monoclonales humanos anti Gal alfa1-3 Gal. XLV Convención anual de AsoVAC. U.S.B. (1995). Caracas, Venezuela.
1997:
19. Wittig O., Alonso J., MONTAÑO R., Romano E.
Producción de anticuerpos monoclonales humanos anti-Rh en un minireactor: optimización del proceso. XLVII Convención anual de AsoVAC. (1997). Valencia, Venezuela.
20. Wittig O., Alonso J., MONTAÑO R., Romano E.
Producción de anticuerpos monoclonales humanos anti-Rh en un minireactor: optimización del proceso. Congreso de Biotecnología Habana’97. (1997). La Habana, Cuba.
21. MONTAÑO R.F.
Asistencia al Congreso Internacional "Therapeutic Antibody Technology". Holiday Inn Hotel. Sept. 21-24 (1997). San Francisco CA, USA.
1999:
22. MONTAÑO R.F., S.L. Morrison, O. Wittig, y J. Alonso.
Creación y caracterización parcial de un anticuerpo recombinante humano polimérico con especificidad por el antígeno Rh(D) humano. XLIX Convención anual de AsoVAC. Universidad Bicentenaria de Aragua. (1999). Maracay, Venezuela
23. MONTAÑO R.F. y S.L. Morrison.
Un micro-ensayo enzimático-colorimétrico para la cuantificación de la activación de complemento mediada por anticuerpos. XLIX Convención anual de AsoVAC. Universidad Bicentenaria de Aragua. (1999). Maracay, Venezuela.
24. MONTAÑO R.F., S.L. Morrison, R. Trihn y J. Denham.
Efecto del dominio constante de la cadena liviana de inmunoglobulina en el ensamblaje, vida media in vivo, reconocimiento antigénico y habilidad para mediar la activación de complemento de anticuerpos quiméricos. XLIX Convención anual de AsoVAC. Universidad Bicentenaria de Aragua. (1999). Maracay, Venezuela.
25. Wittig O., Alonso J., MONTAÑO R.F., Romano E.
Producción de anticuerpos monoclonales múridos con especificidad para los grupos sanguíneos A y B. XLIX Convención anual de AsoVAC. Universidad Bicentenaria de Aragua. (1999). Maracay, Venezuela
26. MONTAÑO R.F. y Morrison S.L.
Un micro-ensayo enzimático-colorimétrico para la cuantificación de la activación de complemento mediada por anticuerpos. Congreso Venezolano de Hematología. (1999). Hotel Hilton – Caracas, Venezuela.
27. MONTAÑO R.F., Morrison S.L., Wittig O., y Alonso J.
Creación y caracterización parcial de un anticuerpo recombinante humano polimérico con especificidad por el antígeno Rh(D) humano. Congreso Venezolano de Hematología. (1999). Hotel Hilton – Caracas, Venezuela.
28. Wittig O., Alonso J., MONTAÑO R.F., Romano E.
Producción de anticuerpos monoclonales murinos con especificidad para los grupos sanguíneos A y B. Congreso Venezolano de Hematología. (1999). Hotel Hilton – Caracas, Venezuela.
29. MONTAÑO R.F.
Sistemas recombinantes para la producción de anticuerpos monoclonales contra antígenos eritrocitarios. Conferencia invitada al Congreso Venezolano de Hematología. (1999). Hotel Hilton – Caracas, Venezuela.
2000:
30. Wittig O., Romano E., MONTAÑO R.F.
Clonación y secuenciación de genes V de cadena pesada y liviana de un anticuerpo humano anti-Gal. L Convención anual de AsoVAC. (2000). USB – Caracas, Venezuela.
31. Wittig O., Rivas B., Romano E., Salazar M., MONTAÑO R.F.
Cuantificación de anti-Rh(D) por citometría de flujo. L Convención anual de AsoVAC. (2000). USB – Caracas, Venezuela.
32. Wittig O., MONTAÑO R.F.
Anticuerpos naturales anti-A, anti-B y anti-Gal reconocen epítopos en cepas de laboratorio de E. coli. L Convención anual de AsoVAC. (2000). USB – Caracas, Venezuela.
2002:
33. Gendzekhadze K., Caballero M., Zerpa M., MONTAÑO R.F., Arminio A., Cleska A., Hernández E., Bernal C., Dominguez C., Benchimol J., Rodriguez C., Becerra J., Guerrero G., Castro J., Rivas Vetencourt P.
Impact of CTLA-4 gene nucleotide-A at position +49 in predicting the acceptance of kidney graft in living related recipients. 13th International Congress on Histocompatibility and Immunogenetics. (2002). Seattle, WA, USA.
34. Rivas Vetencourt P., Gendzekhadze K., MONTAÑO R.F., et al.
Impact of Cytotoxic T Lymphocyte Antigen 4 (CTLA-4) gene polymorphism in predicting acceptance of kidney allograft in a Venezuelan population. XIX International Congress of Transplantation Society. (2002). Miami, FL, USA.
35. Gendzekhadze K., MONTAÑO R.F., Caballero M., Zerpa M., Saltiel C., Rivas Vetencourt P.
Polimorfismo de CTLA-4 en una población de Venezuela. LII Convención anual de AsoVAC. (2002). Coro, Venezuela.
36. Gendzekhadze K., MONTAÑO R.F., Saltiel C., Zerpa M., Caballero M., Rivas Vetencourt P.
CTLA-4 and Cytokine polymorphism in Venezuelan population. 28th Annual Meeting of the American Society for Histocompatibility and Immunogenetics. (2002). Nashville, USA.
37. Gendzekhadze K., MONTAÑO R., Zerpa P., Arminio A., Rodriguez C., Zerpa M., Castro J. Dominguez j., Benchimol J., Rivas-Vetencourt P:
Association of CTLA-4 polymorphism and rejection or steroid treatment response in kidney transplant (KT) patients. 28th Annual Meeting of the American Society for Histocompatibility and Immunogenetics. (2002). Nashville, USA.
2003:
38. Fuenmayor J., Penichet M., Morrison S.L., MONTAÑO R.:
Diseño y construcción de un gen quimérico C5a/IgG3 anti-HER2. II Jornadas del Programa de Postgrados Integrados del FONACIT, área Biología Celular. (Abril 2003). Facultad de Farmacia, Universidad Central de Venezuela. Caracas, Venezuela.
39. Gendzekhadze K., MONTAÑO R.F., Zerpa P., Arminio A., Rodriguez C., Zerpa M., Castro J., Dominguez J., Benchimol J., Rivas Vetencourt P.
Association of CTLA-4 polymorphism and rejection or steroid treatment response in kidney transplant (KT) patients. 29th Annual Meeting of the American Society for Histocompatibility and Immunogenetics. (Nov 2003).Miami, Fl, USA.
40. Miranda M., Suárez N., Galindo M., Morales G., MONTAÑO R.F.
Diseño, Construcción y Caracterización de Vectores de Expresión Eucariota que Codifican Proteínas de Fusión con Potencial Utilidad en Inmunoterapia de Alergias. II Congreso Internacional de Inmunología. (Octubre 2003).Lima, Perú.
2004:
41. Miranda M., Suárez N., Galindo M., Morales G., MONTAÑO R.F.
Construcción y Caracterización de Vectores de Expresión Eucariota que Codifican Proteínas CTLA4-Ig con Potencial Utilidad en Inmunoterapia de Alergias. XV Congreso Venezolano de Alergia, Asma e Inmunología. (Junio 2004). Isla de Margarita, Venezuela.
42. MONTAÑO R.:
Microarreglos de ADN: Principios Básicos y su Impacto en el Campo de la Inmunoterapia. Conferencia invitada en el marco del curso pre-congreso "Biología Molecular Aplicada al Diagnóstico de Laboratorio". XI Congreso de Bioanálisis. (Junio 2004). Caracas, Venezuela.
43. MONTAÑO R.:
Anticuerpos Recombinantes. Conferencia magistral por invitación en el marco de las "X Jornadas Nacionales de Investigación Científica de la Facultad Experimental de Ciencias de la Universidad del Zulia. (Octubre 2004). Maracaibo, Venezuela.
44. Díaz D., MONTAÑO R.:
IgG1 humana polimérica con especificidad por el antígeno "D" del sistema sanguíneo Rh. 54 Convención Anual de AsoVAC. (Noviembre 2004).Universidad de Carabobo, Valencia. Venezuela.
45. Wittig O., Viera N., Romano E., MONTAÑO R.:
Caracterización funcional de fagos recombinantes específicos por el xenoantígeno Galactosa alfa 1-3 Galactosa (Gal). 54 Convención Anual de AsoVAC. (Noviembre 2004). Universidad de Carabobo, Valencia. Venezuela.
46. MONTAÑO R., Wittig O.:
Bacteriófagos recombinantes con especificidad por el xenoantígeno Galactosa alfa 1-3 Galactosa. 54 Convención Anual de AsoVAC. (Noviembre 2004). Universidad de Carabobo, Valencia. Venezuela.
47. Miranda M., Suárez N., Galindo M., Morales G., MONTAÑO R.:
Vectores de Expresión Eucariota que Codifican Proteínas de Fusión con Potencial Utilidad en Inmunoterapia de Alergias. 54 Convención Anual de AsoVAC. (Noviembre 2004). Universidad de Carabobo, Valencia. Venezuela.
48. Díaz D., MONTAÑO R.:
IgG1 humana polimérica con especificidad por el antígeno "D" del sistema sanguíneo Rh. III Jornadas del Programa de Postgrados Integrados del FONACIT, área Biología Celular. (Diciembre 2004). Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas. Caracas, Venezuela.
49. Páez J., Benatuil L., MONTAÑO R., Cardier J.:
Expresión de genes recombinantes en células endoteliales del sinusoide hepático mediante transducción retroviral. III Jornadas del Programa de Postgrados Integrados del FONACIT, área Biología Celular. (Diciembre 2004). Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas. Caracas, Venezuela.
2005:
50. Miranda M., MONTAÑO R.:
Producción y caracterización in vitro de una proteína de fusión CTLA4-IgE. LV Convención anual de AsoVAC. (Noviembre 2005). UCV, Caracas, Venezuela.
51. Fuenmayor J., MONTAÑO R., Penichet M., Morrison S.:
Producción de proteínas de fusión IgG3-C5a con especificidad por el antígeno tumoral HER-2. LV Convención anual de AsoVAC. (Noviembre 2005). UCV, Caracas, Venezuela.
52. Díaz D., MONTAÑO R.:
Caracterización estructural y funcional de proteínas de fusión IgG-IgM con especificidad por el antígeno sanguíneo Rh(D). LV Convención anual de AsoVAC. (Noviembre 2005). UCV, Caracas, Venezuela.
2008:
53. Fuenmayor J., Penichet M., MONTAÑO R.:
Anti-HER2/neu IgG3-C5a and Anti-HER2/neu IgG3-C5adesArg fusion proteins: novel recombinant molecules with specific anti-tumor activity. AACR annual Meeting 2008. (Abril 2008). San Diego Convention Center. San Diego, USA.
H) PUBLICACIONES
Libros y monografías
1. Romano E.L. y MONTAÑO R.:
Nuevos avances en la producción de anticuerpos monoclonales y su aplicación en Hematología. Capítulo por invitación en “Tópicos en Medicina Transfusional” Serie IV pp. 64-87 (1994).
2. MONTAÑO R. y Pujol F. H.:
Recombinant Antibodies.
Capítulo 11 del libro "Artificial DNA: Methods and Applications" CRC PRESS LLC. 2002.
Revistas
1. Soyano A., Pons H., MONTAÑO R., Romano E., Muller-Soyano A. and Somoza R.:
Effect of iron compounds on the immune response in vitro. Proceedings of the XII Latin American Congress of Pharmacology. Recent Advances in Pharmacology and Therapeutics. I. Velasco and S. Romero Eds. Elsevier Science Publishers pp. 401-4 (1989)
2. MONTAÑO R., Romano E.L., Moase E., Cooper D.K., Ye Y., Taylor P., Soyano A. and Tam Y.:
Enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of substances that carry blood group “A” specificity. Transfusion 32:618-23 (1992).
3. Romano E.L., Soyano A., MONTAÑO R., Ratcliffe M., Olson M., Suarez G., Martinez N. and Worsley G.:
Treatment of ABO hemolytic disease with synthetic blood group trisaccharides. Vox Sanguinis. 66;194-9 (1994).
4. MONTAÑO R.F. and Romano E.L.:
Human monoclonal anti-Rh antibodies produced by human-mouse heterohybridomas express the Gal a(1-3) Gal epitope. Human Antibodies and Hybridomas 5:152-6 (1994).
5. Cariani L., Romano E.L., Martinez N., MONTAÑO R., Suarez G., Ruiz I. and Soyano A.:
ABO-hemolytic disease of the newborn (ABO-HDN): Factors influencing its severity and incidence in Venezuela. Journal of Tropical Pediatrics 41:14-20 (1995).
6. MONTAÑO R.F. y Romano E.L.:
Anticuerpos Monoclonales y su aplicación en Hematología. Interciencia 20:194-203 (1995)
7. Araujo J.A., Romano E.L., Brito B.E., Parthe V., Romano M., Bracho M., MONTAÑO R.F. and Cardier J.:
Iron overload augments the development of atherosclerotic lesions in rabbits. Arteriosclerosis, thrombosis, and Vascular Biology 15:1172-80 (1995).
8. Romano E.L., MONTAÑO R.F., Brito B., Apitz R., Alonso J., Gebran S. and Soyano A.:
Effects of ajoene on lymphocyte and macrophage membrane-dependent functions. Immunopharmacology and Immunotoxicology 19(1):15-36 (1997).
9. MONTAÑO R.F. and Morrison S.L.:
A colorimetric enzymatic microassay for the quantitation of antibody-dependent complement activation. Journal of Immunological Methods 222:73-82 (1999).
10. MONTAÑO R.F. y Pujol F.H.:
Anticuerpos monoclonales de primera y segunda generación, aplicaciones biomédicas. Artículo de revisión publicado por invitación en el N° 7 de la revista electrónica “Vitae” (CAIBCO-UCV) Mayo 2001.
11. Montaño R.F. y Morrison S.L.:
Influence of the isotype of the light chain on the properties of IgG. Journal of Immunology. 168:224-231 (2002).
12. Wittig, O., Taylor, P., MONTAño R., Alonso J., and Romano E. Production of human monoclonal antibodies against Gala(1-3)Gal. Xenotransplantation. 8:1-5 (2002)
13. Manzi L, MONTAÑO R., Abad M. J., Arsenak Mi., Romano E., Taylor P. Expression of soluble human complement receptor 1 (sCR1) by a pig endothelial cell line inhibits lysis by human serum. Xenotransplantation. 13:75-9 (2006).
14. Wittig O.L; Alonso J.A; Romano E.L. y MONTAño R.F. Producción de Anticuerpos Monoclonales con especificidad por los grupos sanguíneos A y B. Evaluación de su uso como reactivos hemoclasificadores. Investigación Clínica. 47:254-64 (2006).
15. Paéz J., MONTANO R., Benatuil L., Iacomini J., Cardier J.E. High efficiency and long-term foreign gene expression in liver sinusoidal endotelial cells by retroviral transduction. Endothelium. 13: 279-85 (2006).
16. Gendzedhatze, K. Rivas, P, MONTAño R. Risk of adverse post-transplant events after kidney allograft transplantation as predicted by CTLA-4 +49 and TNF-a –308 Single Nucleotide Polymorphisms: a preliminary study. Transplant Immunology. 16: 194-9 (2006).
17. Paéz J., MONTANO R., Iacomini J., Cardier J.E. Liver sinusoidal endothelial cells as possible vehicles for gene therapy: A comparison between plasmid-based and lentiviral gene transfer techniques. Endothelium. 15:165 (2008).
18. MONTANO R. F., Penichet M. L., Blackall D. P., Morrison S. L., Chintalacharuvu K. R. Recombinant polymeric IgG anti-Rh: A novel strategy for development of direct agglutinating reagents. Journal of Immunological Methods. 340:1-10 (2009).
19. Fuenmayor J., Pérez-Vasquez K., Pérez-Witzke D., Penichet M.L., MONTANO R.F. Decreased survival of human breast cancer cells expressing HER2/neu on in vitro incubation with an anti-HER2/neu antibody fused to C5a or C5a desArg. Mol Cancer Ther. 9: 2175-85 (2010).
I) PATENTES
MONTAÑO R.F. y Morrison S.L.:
Rh hybrid antibody. Patent No. US 6,475,749 B1. Date: Nov. 5, 2002
J) REPORTES TECNICOS:
Romano E.L., Soyano A., MONTAÑO R., Suárez G., Pérez N. and Reyes M.
Study of the use of soluble synthetic A and B blood group substances for the treatment of ABO hemolytic disease of the newborn. 23 pages, 5 tables, 15 figures. Presentado a Chembiomed LTD, Edmonton, Canada. Junio 1989.
