Desde los inicios mitológicos, la reposición de la sangre perdida por medio de sustitutos no sanguíneos ha sido una búsqueda constante. Desde el advenimiento de la transfusión de sangre a comienzos del siglo XX, la práctica transfusional se ha convertido en un procedimiento universal en el quehacer médico-quirúrgico. A pesar de esto, en años recientes se ha retomado el interés por la “sangre artificial”, término que no es muy adecuado. La razón para este renovado interés radica en el incremento progresivo de los costos de la colecta, procesamiento y distribución de sangre y componentes de esta, sensibilización de la opinión pública sobre la seguridad de la sangre alogénica en términos de su potencialidad como transmisora de agentes infecciosos, las reacciones adversas a la transfusión y, sobre todo en países como Colombia, la corta oferta de sangre frente a la demanda no satisfecha.
Los primeros ensayos de laboratorio sobre la sustitución de la sangre por mezclas artificiales datan de 1937. Ha sido largo el camino recorrido desde entonces habiéndose alcanzado avances notables. Estos avances se restringen a sustitutos del plasma y a sustitutos de los eritrocitos. Las características ideales de estos sustitutos son: no tener propiedades antigénicas, tener estabilidad a temperatura ambiente, largo tiempo de conservación, suficiente vida media en la circulación, ausencia de toxicidad y, en el caso de los sustitutos de eritrocitos unas propiedades similares a los eritrocitos naturales en términos de su capacidad para transportar O2 y CO2.
En el caso de los sustitutos del plasma, se ha buscado que estos cumplan con algunos de los atributos fisiológicos del plasma sanguíneo, esto es, el mantenimiento del volumen de compartimiento intravascular, condición necesaria para la perfusión tisular. En la actualidad se usan rutinariamente sustitutos que pueden agruparse en dos categorías: soluciones de cristaloides y suspensiones coloidales, cada una de estas con sus indicaciones y restricciones de manejo.
Dado que está firmemente establecido que uno de los atributos fisiológicos fundamentales de los eritrocitos es el transporte de los llamados gases respiratorios, resulta evidente que cualquier aproximación a un sustituto de los eritrocitos debe ser capaz de emular, de alguna manera, esta funcionalidad transportadora. Como sería de esperar, es la misma hemoglobina la primera molécula candidata para cumplir este papel. Los primeros experimentos de infusión a humanos de soluciones de hemoglobina libre de estroma eritrocitario se realizaron en 1949. A pesar de muchos avances, aun no se dispone de un sustituto de eritrocitos basado en hemoglobina y licenciado para su uso clínico.
En la búsqueda de un transportador artificial de gases respiratorios basado en hemoglobina (Hb), han surgido varios obstáculos que paulatinamente se han ido solucionando. El primero de dichos obstáculos es el hecho que en solución acuosa la molécula tetramérica de Hb se disocia espontáneamente en dos dímeros ab, los cuales tienen un peso molecular inferior al límite de exclusión de la barrera de filtración glomerular, lo cual tiene como resultado una rápida depuración de la circulación y una notable nefrotoxicidad. La estrategia utilizada para evitar la disociación de la Hb ha sido buscar la estabilización del tetrámero mediante entrecruzamiento covalente de las cadenas de globina. Se han desarrollado y se siguen desarrollando reactivos de entrecruzamiento, varios de los cuales han logrado el objetivo buscado.
Otro obstáculo es el hecho que en solución acuosa a pH fisiológico, la Hb al estar en un medio desprovisto de 2,3-difosfoglicerato (2,3-DPG) muestra una elevada afinidad para el O2, con una P50 alrededor de 12 mm Hg, lo cual la hace inadecuada para ceder este gas a los tejidos en las condiciones reinantes en la circulación capilar sistémica. La estrategia utilizada para aumentar la P50 ha sido el uso de reactivos de entrecruzamiento selectivos que bloquean los extremos amino-terminal de las cadenas b. Una de las especies moleculares mejor lograda mediante entrecruzamiento covalente es la denominada diaspirina-Hb, la cual no se disocia en dímeros y posee una afinidad por el O2 similar a aquella de la Hb eritrocitaria nativa. Lamentablemente el bloqueo de los amino-terminales reduce la capacidad de formación de carbamino-Hb y con ello de transporte de CO2 químicamente combinado, pero esto es un mal menor. Otra aproximación ha sido embeber tanto a la Hb como a análogos del 2,3-DPG al interior de liposomas de fosfolípidos, lo que algunos han llamado nanocélulas. Esta estrategia aun no ha dado los frutos esperados, en contraste con el éxito obtenido con la tecnología de liposomas para administrar ciertos medicamentos. Una tercera estrategia utilizada ha sido la polimerización de la Hb, tanto homopolímeros como heteropolímeros con otras macromoléculas, proteicas y no proteicas; los resultados de esta estrategia son promisorios aunque todavía incipientes.
Un obstáculo adicional es que en solución acuosa a pH fisiológico el hierro ferroso de la Hb se oxida al estado férrico (formación de meta-hemoglobina, MetHb), la cual no funciona para el transporte de O2. Se han ensayado varias estrategias para evitar la oxidación de la Hb en los sustitutos con base en esta. Una de estas estrategias ha sido el uso de entrecruzamiento molecular selectivo; otra, la síntesis de heteropolímeros de Hb con enzimas removedoras de radicales libres del oxígeno, como por ejemplo la catalasa.
Ninguno de los productos arriba mencionados tiene propiedades antigénicas importantes y tampoco requiere de pruebas de compatibilidad. Muchos de estos tienen una vida media vascular entre 18 y 25 horas lo cual es adecuado para su uso agudo en reanimación del shock hemorrágico, pueden ser almacenados a 4°C o a temperatura ambiente por 1-2 años y podrían tener un precio razonable. Así las cosas, muchos de estos productos avanzaron exitosamente por las etapas de ensayos preclínicos y al menos tres de ellos llegaron a la fase de ensayos clínicos II y III. En el curso de estos estudios se acumuló evidencia que sugiere que el uso de estos sustitutos puede estar asociado con un incremento en la mortalidad en comparación con los protocolos habituales de reanimación; tal vez, el efecto indeseable más importante del uso de estos sustitutos es su capacidad para generar vasoconstricción, con hipertensión pulmonar y sistémica, riesgo de infarto del miocardio, de isquemia cerebral y de falla renal aguda, lo cual motivó la decisión de suspender indefinidamente la continuación de los ensayos clínicos. La razón de esta capacidad para generar marcada vasoconstricción estriba en que estos sustitutos adolecen de la incapacidad para emular a los eritrocitos nativos en otro de sus importantes atributos fisiológicos, esto es, la regulación del tono vascular, de la presión arterial y de la perfusión tisular, adaptándolas a las condiciones de oxigenación tisular, en buena parte mediante la remoción/generación de óxido nítrico (NO). Actualmente se encuentra en curso el planteamiento de estrategias para superar este obstáculo.
Los perfluorocarbonos (PFC) son moléculas carbonadas alifáticas con multisustitución de hidrógenos por halógenos, con un peso molecular de 400 a 500 daltons. Como es de esperar de esta estructura química, son altamente hidrofóbicos y, por lo tanto, insolubles en agua. Los PFC se desarrollaron como aceites aislantes para reactores nucleares y fueron introducidos en el campo de la medicina en 1966. Estas moléculas poseen la propiedad de unirse reversiblemente a gases como O2, CO2 y NO, siendo por lo tanto capaces de transportarlos. La cinética de la combinación PFC/gas es lineal y, por lo tanto, directamente proporcional a la presión parcial del gas en cuestión. Para su administración intravenosa, dada su insolubilidad en agua, es necesario prepararlos como una emulsión con un tamaño de partícula alrededor de 0.2 mm. Así preparados carecen de antigenicidad, son estables por dos años y son relativamente bien tolerados aun administrados en una suspensión concentrada al 60%, careciendo de actividad vasoconstrictora y de toxicidad renal. Algunos PFC estuvieron en el mercado por un tiempo.
A pesar de las notables y atractivas características de los PFC como transportadores de gases respiratorios, la cinética lineal de su combinación con estos, hace que para lograrse una fracción de extracción de O2 similar a la necesaria para mantener un VO2 fisiológico, sea menester que el paciente inhale una mezcla con una FiO2 mayor de 0.7, lo cual resulta ser impráctico para su uso en circunstancias extrahospitalarias. Por otro lado, los PFC activan al sistema mononuclear fagocítico lo cual resulta eventualmente en el desencadenamiento de un cuadro inflamatorio sistémico, lo cual es un efecto adverso serio, pero que también existe en la transfusión de eritrocitos.
Es de esperar que en un futuro próximo, las estrategias implementadas o en curso de ser implementadas para superar los obstáculos encontrados en el desarrollo de los sustitutos de eritrocitos, logren su objetivo. Por fortuna, estas estrategias están basadas en un abordaje de ingeniería molecular. A diferencia de los problemas morales, teológicos, políticos o estéticos, cuando los problemas de la humanidad se convierten en problemas de ingeniería, tarde o temprano tienen solución.
ANEXO:
Tipo de presentación: ensayo
Conflictos de interés del autor: ninguno
Financiación: para la elaboración y presentación de este ensayo no se solicitó ni se utilizó ninguna financiación específica.
Centro Médico Imbanaco. Santiago de Cali, Colombia
Palabras Claves: Aféresis, Eficiencia Relativa de Recolección de Células CD34+, Validación.
INTRODUCCIÓN
En la actualidad el trasplante de células progenitores hematopoyéticos de sangre periférica (CPSP) es una alternativa terapéutica para el tratamiento de varias enfermedades hematológicas y ciertos tumores sólidos (1). Estas células son movilizadas de la médula ósea a la circulación con la administración de factor estimulante (G-CSF) sólo o con quimioterapia, y recolectadas a través de máquinas de aféresis(2). En la recolección de células se debe obtener un producto de calidad que se refleje en beneficios tanto para el receptor como para el donante. Además al optimizar el procedimiento se pueden disminuir costos.
Entidades de acreditación han diseñado estándares para la obtención, procesamiento y almacenamiento de células progenitoras hematopoyéticas. En el ámbito internacional hay varias publicaciones de estos estándares (AABB, FACT, CAT, JACIE). En Colombia aún no se ha reglamentado el manejo de los progenitores hematopoyéticos por lo tanto es necesario la implementación voluntaria de estos estándares para garantizar la calidad en el proceso. Entre estos estándares de calidad está la validación de las máquinas utilizadas para la recolección de las CPHSP (6-8), pero en nuestro entorno aún no se realiza de manera rutinaria. A pesar de que hay estudios publicados que demuestran que las máquinas de aféresis son eficientes en la recolección de CPSP es necesario evaluar la eficiencia de los recolectores celulares y así validar su utilización (9). El objetivo del estudio es evaluar la eficiencia relativa de recolección de células CD34+ del separador Celular COM.TEC con los equipos P1Y (gran volumen) Programa MNC y RVY (volumen reducido) Programa RV-PBSC. Se incluyeron dos variables hematocrito en el producto y porcentaje de pérdida de plaquetas en el donante por considerar su importancia en los posibles efectos colaterales que pueden llegar a provocar en el receptor y donante respectivamente.
METODOLOGÍA
Se realizó un estudio comparativo en 19 procedimientos de aféresis para la recolección de células progenitoras de sangre periférica realizados durante el periodo junio/2009 – febrero/2010. Se utilizaron equipos RVY en 9 procedimientos y equipos P1Y en 11 procedimientos. Se revisaron los registros del recuento de células CD34+ de sangre periférica del donante y del producto recolectado, la cantidad de sangre movilizada en la máquina y el volumen del producto recolectado.Las células CD34+ fueron analizadas por citometría de flujo y a todos los donantes se les movilizaron tres volemias. Se determinó la eficiencia relativa de recolección de células CD34+ (ERR) definida como el porcentaje de células CD34+ totales obtenidas en función del número total de células CD34+ procesadas.(10) Para la evaluación de la ERR de células CD34+ se tomó como referencia los valores empleados por el Banco de Sangre y Tejidos de Barcelona: en el 50% o más de los procedimientos se debe obtener una ERR de células CD34+ mayor o igual a 30%.(10). Se analizó el comportamiento del hematocrito de los productos recolectados y el porcentaje de pérdida de plaquetas en el donante. Para la comparación de los resultados entre los equipos se utilizó el análisis de varianza de una vía y la prueba de probabilidad exacta de Fisher. Se estableció a priori un nivel de significación estadística α = 0,05
RESULTADOS
La media de la ERR de los 19 procedimientos fue de 48.83% con una desviación típica de 36.82%. Se observaron diferencias estadísticamente significativas según equipo utilizado.
El 57,9% de los procedimientos tuvieron una ERR >30%. Con el equipo P1Y se obtuvo un porcentaje de 90% altamente significante con respecto al obtenido con el equipo RVY (22%). Se encontraron también diferencias estadísticamente significantes con respecto a las media del Hematocrito de los productos de aféresis (valor_p = 0,035). La perdida promedio de plaquetas en el donante con el equipo P1Y fue del 53.32% y con el equipo RVY fue del 42,18%. Estas diferencias no fueron estadísticamente significantes.
Descriptivas e indicadores de evaluación
Descriptivas
Valores
ERR (%)
Mínima - Máxima
Media ± Desviación estándar
Percentil 25
Percentil 50
Percentil 75
n = 19
9 – 132
48,8 ± 36,8
23,6
32,7
71,3
CATEGORÍAS DE EFICIENCIA (%)
9 – 29
30 y más
%
42,1
57,9
Hematocrito de la aféresis (%)
Mínima - Máxima
Media ± Desviación estándar
Percentil 25
Percentil 50
Percentil 75
n = 19
0,7 – 9,0
4,6 ± 2,1
3,2
4,5
6,3
Pérdida de plaquetas (%)
Mínima - Máxima
Media ± Desviación estándar
Percentil 25
Percentil 50
Percentil 75
n = 19
18 – 75
48,0 ± 14,6
37,5
49,2
59,4
Indicadores
Equipo
Valor_p
P1Y (n = 10)
RVY (n = 9)
ERR (%)
73,2 ± 34,9
21,7 ± 10,1
0,001*
%Procedimientos con ERR> 30%
90%
22%
0,005*
Hematocrito de la aféresis (%)
3,7 ± 1,8
5,7 ± 1,9
0,035*
Pérdida de plaquetas (%)
53,3 ± 17,5
42,2 ± 8,1
0,098
* Diferencias estadísticamente significantes a nivel α = 0,05
DISCUSIÓN
El trasplante de progenitores hematopoyéticos de sangre periférica se ha convertido en una alternativa eficaz para el tratamiento de enfermedades hematológicas y tumores sólidos(2). En este estudio los pacientes trasplantados presentaban diagnostico de Mieloma Múltiple, Linfomas, Leucemias y Neuroblastoma.
Parte fundamental del trasplante de células progenitoras hematopoyéticas de sangre periférica es su recolección (2). Es de vital importancia para el éxito de un trasplante el umbral de células CD34+ recolectadas. Al aumentar la dosis de administración del CD34+ aumenta la rapidez del injerto para neutrófilos y plaquetas, asociándose con menores infecciones y transfusiones, menor estancia hospitalaria y menores costos (2-3).Por lo tanto es importante optimizar cada procedimiento para recolectar mayor cantidad de células y evitar realizar otros procedimientos.El presente estudio mostró que el separador celular COM.TEC tiene una ERR de células CD34+ promedio de 48.8%. Este resultado permite validar el separador para la recolección de CPSP de acuerdo a los parámetros del Banco de Sangre y Tejidos de Barcelona(10). La comparación de la ERR de células CD34+ de los dos equipos utilizados permite validar el separador empleado el equipo P1Y (gran volumen) programa MNC más no el equipo RVY. Los efectos de una eficiente recolección del separador se reflejaron en que solo fue necesario realizar una sola recolección a catorce de los dieciséis pacientes.
En la congelación del producto recolectado de la aféresis se produce lisis de los glóbulos rojos dejando hemoglobina libre que implica riesgos de complicaciones renales de los pacientes después de la infusión. Al obtener un producto menos contaminado de glóbulos rojos se disminuye este riesgo (5). El comportamiento del hematocrito del producto del aféresis sugiere que el producto obtenido en el procedimiento no presenta mayor riesgo de contaminación con glóbulos rojos.
Durante la recolección del CPSP la frecuencia de los procedimientos podrían causar molestias y efectos colaterales en los donantes, entre ellos está la pérdida de plaquetas y algunos donantes pueden requerir soporte transfusional (4). Durante la recolección se observó una perdida significante de plaquetas con ambos equipos pero permanece dentro de los rangos reportados en la literatura con otros separadores(9).
A futuro es importante estudiar otras variables que puedan influir en la ERR de células CD34+. En este estudio no se incluyeron debido al número reducido de casos.
Este estudio demuestra la importancia de validar los separadores para la recolección CPSP con el fin obtener un producto de alta calidad, optimizando el procedimiento y disminuyendo riesgos colaterales en beneficio tanto para el receptor como para el donante.
CONCLUSIONES
La máquina de aféresis utilizada en el Centro Médico Imbanaco es eficiente para la recolección de células progenitoras de sangre periférica. Se recomienda utilizar el equipo P1Y en lugar del RVY por ser eficiente y con un producto menos contaminado de eritrocitos.
Este estudio muestra la necesidad de establecer metodologías para validar las máquinas de aféresis y seleccionar los equipos que brinden, por procedimiento, mayor eficiencia en la recolección de células CD34+, con una baja contaminación de eritrocitos. De esta manera se reduce tanto el número de aféresis por trasplante como los riesgos en el donante y costos.
REFERENCIAS
L. Ramiro infante1 Trasplante autólogo de progenitores hematopoyéticos de sangre periférica. experiencia en dos centros del Banc de Sang i Teixits. España SETS 2009.
Thomas Lane, MD, and John D. McMannis, PhD Hematopoietic Progenitor Cells Collected by Apheresis. Technical Manual 16th edition 2007 AABB
Standards for Hematopoietic Progenitor Cell and Cellular Product Service. Third Edition AABB
Estándares de acreditación en obtención, procesamiento y almacenamiento de células progenitoras hematopoyeticas. Comité de acreditación en transfusión. 3ª edición. 2007.
Cellular therapy product collection, processing, and administration. Acreditation Manual. Foundation for the Accreditation of Cellular Therapy. Third Edition. November 2007
N. Shwella, K. Monovassaghi, S. Scheding, N. Ahrens. Comparison of two leucokapheresis programs for computerized collection of blood progenitor cells on a new cell separator. Transfusion Vol,43 January 2003.
Gregorio Marín Henao. Aféresis de células progenitoras Hematopoyeticas um plan de validación del separador celular COBE SPECTRA. SETS 2009.
Armando Cortes Buelvas1*, Martha Gallego de García2* y Sergio Jaramillo Velásquez3*
1. Patólogo clínico - Director Hemocentro del Valle del Cauca
Profesor Titular y Jefe Departamento de Patología - Facultad de Salud - Universidad del Valle
Jefe Departamento de Patología - Hospital Universitario del Valle
2. Directora Programa de Bacteriología Universidad Católica de Manizalez
3. Jefe Departamento Laboratorio Hospital Pablo Tobón Uribe. Medellín, Colombia
*Grupo de investigación en medicina transfusional, Universidad Católica de Manizales
Debido a que la mayoría de las pruebas se han desarrollado para el diagnóstico clínico, donde es elevado el índice de sospecha y alta la probabilidad de infección, su aplicación es un problema en situaciones de baja prevalencia como la población de donantes de sangre. La idoneidad de cada método para la selección de donantes debe tener en cuenta varios criterios, entre ellos la prevalencia de la inmunidad contra la malaria en la población de donantes, la sensibilidad de la prueba (para las especies en particular), costo, fiabilidad, rápidez y complejidad.
Una consideración primordial es la sensibilidad. Se ha comprobado que tan sólo 10 parásitos por unidad de glóbulos rojos son suficientes para transmitir la infección1. En el contexto de una unidad de glóbulos rojos que contiene 250 ml, se requiere de una prueba con sensibilidad de 0,00004 parásitos por microlitro de globulos rojos para identificar una donación potencialmente infecciosa.
Con respecto a las pruebas que detectan anticuerpos es fundamental su sensibilidad a los bajos títulos de anticuerpos, expresados en los inicios de la infección; y la especificidad en las poblaciones de baja prevalencia, así como el reconocimiento de anticuerpos dirigidos contra las cuatro especies
Microscopía
La prueba que más se aplica para el diagnóstico de la malaria es el examen de gota gruesa o extendidos en laminas coloreadas con Giemsa o Wright, siendo considerada la prueba de diagnóstico estándar de oro, principalmente por su capacidad para permitir diferenciar la especie, cuantificación de la parasitemia y la evaluación de la distribución de las formas del parásito, lo cual puede ayudar en la evaluación de la gravedad de la enfermedad y, a veces, influye en la elección de la terapia; y ser relativamente barata2
En manos experimentadas, se puede lograr una sensibilidad de entre 5 y 10 parásitos por microlitro, pero la mayoría de los laboratorios logran una sensibilidad de sólo alrededor de 500 parásitos por microlitro3-5. Mientras la sensibilidad y especificidad en condiciones de campo puede ser tan bajo como 10% y 71%, respectivamente5,6. El tiempo necesario para leer las láminas (20 minutos por lámina negativa) y la falta de sensibilidad, la hace no viable para el estudio de la sangre en áreas no endémicas.
También se han aplicado para diagnóstico técnicas de microscopía de fluorescencia basadas en coloraciones (por ejemplo, naranja de acridina) con afinidad por los ácidos nucleicos parasitarios7. Con estas técnicas hay dificultad para discriminar entre manchas de fluorescencia y ácidos nucleicos parasitarios, y la sensibilidad es limitada a 100 parásitos por microlitro. Aunque el tiempo de procesamiento es más reducido que la microscopía de rutina, se requiere de un equipo especial. La técnica con naranja de acridina tiene una mayor sensibilidad para Plasmodium falciparum, pero reducida para las especies no falciparum y una especificidad reducida debido a la tinción de ADN de los leucocitos8. Por estas razones, los métodos fluorescentes ofrecen poca o ninguna mejora con respecto a la técnica estándar de tinción.
En general, las técnicas microscópicas tienen varias limitaciones que las hacen inadecuadas para la pesquisa universal o especifico de donantes de sangre. Específicamente, les falta la sensibilidad necesaria para detectar todas las unidades infectadas, gastan demasiado tiempo (en general, requieren de una hora o más para la preparación y el examen detallado), y requiere un importante conocimiento técnico y equipo especializado, cuando se utilizan métodos de fluorescencia. En general, la microscopía es laboriosa y poco adecuada para el uso de alto rendimiento3, siendo un desafio en las bajas densidades del parásito.
Detección de antígenos
Se han desarrolado sobre la base de la detección de proteínas ricas en histidina 2, lactato deshidrogenasa plasmodial o aldolasa. Estas pruebas fueron diseñadas para diagnóstico rápido, utilizando diversas técnicas inmunocromatográficas (TIC) para la detección de antígenos en la sangre en pacientes sospechosos de paludismo.
La mayoría de estas pruebas disponen de una "tira" y se pueden utilizar con un mínimo de entrenamiento y ofrecen un resultado en 10 a 20 minutos. Los costos y la relativa insensibilidad han restringido su aplicación como pruebas de pesquisa en donantes.
Más recientemente, se puede realizar la detección de antígenos mediante el método de ELISA aplicada para sangre total o plasma. Estas determinaciones tienen sensibilidades de 100 a 1.000 parásitos/ml, dependiendo de la especie y el método, en general, comparable a la microscopía de rutina, excepto cuando ésta última se realiza por personal experimentado9.
Sin embargo se deben considerar además de las limitaciones de costos y la exigencia de equipos de procesamiento más complejos, que desanima su aplicación en los países endémicos, que las pruebas de detección de antígenos no son lo suficientemente sensibles para excluir totalmente la presencia de parásitos de la malaria en una unidad de sangre destinada a la transfusión. Aunque son rápidas y razonablemente objetivas, su sensibilidad no es suficiente para su utilización en un contexto de selección, ya que su sensibilidad global es todavía baja.
Aunque algunos han propuesto la combinación de la detección de antígenos con la de anticuerpos contra la malaria como medio para aumentar la sensibilidad10
En países no endémicos cuando se combinan la detección de anticuerpos y antígenos se mejora la sensibilidad global. En Francia, de los sueros positivos por inmunofluorescencia indirecta (IFAT), 71% fueron detectados únicamente por la IgG ELISA, aumentando en 88% la sensibilidad si se adiciona la determinación de antígenos. Demostrándose que esta combinación puede ser adecuada para sustituir a la IFAT que requiere mayor mano de obra11.
Por otro lado IFAT ha demostrado ser menos sensible que un nuevo EIA recombinante para la detección de anticuerpos12. Igualmente el servicio de sangre de la Cruz Roja Australiana estudió los sueros de pacientes agudos con gota gruesa positiva encontrando una pequeña ventaja de sensibilidad para la estrategia combinada sobre la de anticuerpos solamente13
En general estas pruebas pueden distinguir entre especies P. falciparum y no-falciparum al utilizar dos anticuerpos pan-específicos que reconocen ya sea lactato deshidrogenasa (pLDH) o HRP-2 - y un anticuerpo específico de P. falciparum.
En muchos aspectos, las TIC parecen ideales: son rápidas (< 30 minutos), pueden soportar temperaturas de hasta 30 +- 1°C, y parecen lo suficientemente simples para su utilización por los profesionales y técnicos de la salud o incluso voluntarios. Sin embargo, la literatura revela inconsistencias en la sensibilidad y especificidad, variando según los productos entre los estudios y la evaluación del mismo producto. Las posibles explicaciones incluyen la falta de una norma de referencia universal; diversa calidad de la microscopía; deficiente diseño del estudio, diferencias en el almacenamiento de las TIC; y mucha variabilidad en la calidad de las prueba; y la configuración de las poblaciones114-118.
Un reciente meta-análisis de las TIC aplicado a viajeros con reacción febril no inmune evaluó la capacidad de las TIC para descartar la infección por P. falciparum18sobre la base de más de 5.000 casos en 21 estudios controlados aleatorios y ciegos; la prueba para detectar P. falciparum basada en HRP-2 tiene 88-99% de sensibilidad y 95-100% de especificidad. La prueba basada en pLDH fue similar en especificidad pero más baja en sensibilidad (79-95%). Ambas pruebas mostraron una baja probabilidad de coeficientes negativos (0,08 y 0,13, respectivamente), indicando su utilidad para excluir la infección por P. falciparum. Los autores concluyeron que, si bien se requieren más estudios, las TIC parecen ser un útil complemento de la microscopía para estudiar viajeros que retornan de áreas endémicas en los centros que carecen de expertos microscopistas para el diagnóstico de P. falciparum.
Éste meta-análisis también puso de relieve algunas deficiencias de las TIC. La sensibilidad fue baja y variable para la detección de especies no falciparum. La sensibilidad para P. falciparum estuvo por debajo de los 100 parásitos/ml. Los falsos negativos en estos estudios son atribuidos a un efecto prozona19 o a un raro polimorfismo o delección de HRP-2116-118. Por tanto, un TIC negativo debe ser confirmado por metodos alternativos antes de excluir la malaria2, 22
Los estudios realizados con TIC en regiones donde la malaria es endémica muestran una gran variabilidad en los resultados8,14,16. Esto puede ser debido a los factores de confusión que se han mencionado anteriormente, incluidas las imprecisiones de la microscopía.
Una revisión sistemática reciente, utilizando el análisis Bayesiano considerando la verdadera prevalencia de la infección en cada estudio y pruebas de exactitud comunes entre los estudios, evaluaron las técnicas de diagnóstico de malaria23 reveló que para el diagnóstico de P. falciparum en los países endémicos, las TIC basadas en HRP-2 tienen la más alta sensibilidad (92,7%) y especificidad (99,2%), aunque fue superior la microscopía para la detección de especies no-falciparum.
Las TIC tienen una serie de inconvenientes para su uso en los países endémicos. Tanto las basadas en HRP-2- con las pLDH son poco fiables en la detección de especies diferentes de Plasmodium falciparum, siendo un problema para su uso en América del Sur y Asia14,16, suelen alterarse con altas temperaturas o humedad durante el transporte o almacenamiento24, lo cual reduce la sensibilidad de la prueba25
Un estudio reciente de los trabajadores de la salud de las comunidades rurales en Filipinas y voluntarios en la República Democrática Popular Laos constató que un informe detallado por escrito, ayudado con una breve sesión de orientación mejora significativamente el rendimiento y la interpretación de las TIC26. Otros han informado tasas de disminución de errores con la experiencia27
Ensayos de ADN plasmodial
Los ensayos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), en particular, han demostrado una mayor sensibilidad y especificidad frente a otras técnicas de diagnóstico disponibles8,28 y han sido evaluados para el tamizaje de donantes de sangre. En un estudio con donantes de sangre vietnamitas, la PCR ha demostrado ser significativamente más sensible que la microscopía, al detectar 19 de 30 en comparación con 4 de 30 de los donantes con bajo nivel parasitémico, respectivamente29
En un estudio similar español, un ensayo de PCR específico para P falciparum aplicado a donantes potencialmente expuestos demostró una sensibilidad entre 0,004 y 0,04 parásitos por microlitro y fue capaz de detectar casos de donantes con microscopía negativa, presumiblemente infecciosos30. Los autores defienden el uso de PCR combinado con el interrogatorio de donantes en una estrategia orientada a reducir el período de aplazamiento de 3 años a 6 meses en los inmigrantes recientes a España.
A pesar de la notable mejora en el límite de detección de estos ensayos de ácidos nucleicos (NAT) sobre otras técnicas disponibles, incluso la sensibilidad de 0,004 parásitos por microlitro es 100 veces menor de la sensibilidad requerida (0,00004 parásitos por microlitro) para detectar todas las posibles unidades infecciosas.
NAT es, por lo tanto incapaz de detectar a las personas que puedan haber estado expuestas al paludismo, tienen anticuerpos positivos, y tienen episodios parasitémicos transitorios. Esta limitación, junto con la naturaleza compleja y el alto costo comparativo, la hace en la actualidad inadecuada para ensayos NAT universal o específica para la detección de donantes de sangre.
La cuestión clave es si estas pruebas moleculares pueden detectar el más bajo nivel de los parásitos que puedan transmitir el paludismo, teniendo en cuenta el tamaño del inóculo31; por ejemplo, en el nivel de un parásito por ml de sangre total (por debajo de la sensibilidad de las citadas pruebas PCR), una unidad de glóbulos rojos contendría al menos 200 parásitos, un nivel en el que claramente puede ocurrir la transmisión.
Sin embargo, este nivel sería imperceptible a menos que el volumen de extracción de muestra para la prueba genómica sea al menos de 1 ml de sangre y toda sea utilizada para la PCR. El uso de este volumen de muestra es un problema debido a que grandes volúmenes de muestras no son ideales para las pruebas de rutina. Es evidente que el nivel de parasitemia en la donación puede ser en realidad mucho menor, por tanto, los GR podrían transmitir la malaria. Los experimentos en ratones con infección por P. chabaudi ha demostrado infectividad con una dosis de 100 parásitos32
Así, en países no endémicos incluso el uso de las técnicas más sensibles para la detección de ADN de la malaria no serían suficientes para asegurar que una donación esta libre de parásitos. Aunque se ha sugerido que la combinación de PCR y el interrogatorio de donantes es una forma efectiva de reducir al mínimo el riesgo de transmisión del paludismo por transfusión30; sin embargo, la combinación del aplazamiento por entrevista y la detección de anticuerpos es mucho más eficaz y fiable, y, de hecho, es una estrategia más económica12,33
En los países endémicos, sin embargo, la PCR se ha sugerido para identificar las donaciones infecciosas, con parasitemia detectables por debajo del nivel de sensibilidad de la gota gruesa. En comparación con la gota gruesa no hay duda de que un PCR bien diseñado puede ser más sensible34,35
Sin embargo, la rutina de detección de PCR no está ampliamente disponible en la mayoría de los países con paludismo endémico, el costo es prohibitivo y casi siempre no está disponible la infraestructura necesaria. Por lo tanto, en países donde el paludismo es endémico, la PCR no es, o en el futuro previsible, una alternativa viable a la gota gruesa para el tamizaje de las donaciones de sangre.
Las pruebas de PCR se han diseñado, centradas en una multi-copia de una subunidad conocida como 18S rRNA genes (18S rRNA) que se encuentran en todas las especies de Plasmodium36
Algunas variaciones del PCR han permitido una mayor facilidad de uso, se ha automatizado el análisis39-41 y se ha mejorado su capacidad hasta detectar 0.1 parasito/ml37 y la infección sub microscópica por Plasmodium41-43
Sin embargo, los métodos de PCR son muy demandantes en mano de obra y consumen mucho tiempo (6-8 h) para ser usado como una prueba de selección de primera línea. Además, puede ocurrir contaminación cruzada durante el procesamiento.
El desarrollo de la PCR en tiempo real para el diagnóstico de malaria resuelve muchas de estas dificultades44-48. La sensibilidad y especificidad son tan altas como la PCR convencional, y su sistema cerrado reduce el riesgo de contaminación cruzada, mientras el uso de técnicas rápidas para el aislamiento de ADN, acorta el tiempo de la prueba a menos de una hora48-50. Sin embargo, aun persisten algunos inconvenientes técnicos con el PCR en tiempo real que incluye la variación en la secuencia 18S rRNA genes del Plasmodium ovale y Plasmodium malariae, que puede provocar un menor reconocimiento de especies específicas de los primers y resultados falsos negativos51-52. Además, las infecciones mixtas por especies menores no pueden ser amplificadas debido a la inhibición competitiva de los primers51; esto puede evitarse mediante el uso de cebadores específicos de especie, o la amplificación de un gen de cada especie53
En países no endémicos, la PCR en tiempo real esta cada vez más disponible, aunque es necesario realizar análisis de coste-beneficio locales para evaluar la relación coste-eficacia. Algunos laboratorios clínicos ya están utilizando PCR en tiempo real para el diagnóstico de los casos importados de paludismo53; sin embargo, estos tienden a ser laboratorios de referencia e investigación, lo que exige el transporte de las muestras reduciendo considerablemente la inmediatez de esta prueba. Se hace necesario para el futuro, disponer de máquinas completamente automatizada de PCR en tiempo real en los punto de atención de donantes, pero pasará algún tiempo antes de que estos dispositivos estén disponibles, sean confiables y asequibles54-55
El uso de la PCR en la mayoría de los países endémicos es prohibida por el costo, aunque hay laboratorios regionales que van adquiriendo las capacidades para el PCR convencional56 y están en desarrollo termocicladores para PCR de bajo costo portátiles57, conservando la sensibilidad con estos ajustes para detectar la malaria asintomática58-60. En una serie de estudios con muestras de regiones endémicas encontraron 97% de especificidad de la PCR en comparación con la microscopía44, 61.
Otras técnicas ahorran el aislamiento de ADN mediante el uso del sobrenadante de la sangre tratada al calor, y no requiere de la desnaturalización de ADN, lo que elimina la necesidad de termocicladores. En un estudio retrospectivo usando el gen 18S rRNA específico para P. falciparum, esta técnica llamada de amplificación isotérmica “loop” (LAMP) mostró 95% de sensibilidad y especificidad del 99% en comparación con el PCR convencional62. En otro estudio con cuatro grupos de especies mostró un 98,5% de sensibilidad y especificidad de 94,3% en comparación con la microscopía63. Esta técnica (LAMP) es simple, sensible (10-100 copias de genes), y rápida (tarda una hora)62,63 y es menos costosa que la PCR63. Sin embargo, los reactivos requieren almacenamiento en frío, y se necesitan ensayos clínicos para validar la viabilidad y la utilidad clínica del LAMP.
Otra técnica cuantitativa basada en la amplificación en secuencia de los ácidos nucleicos (QT-NASBA) utiliza el ARN en lugar de ADN como plantilla para la amplificación de ácidos nucleicos, y se ha aplicado a los diagnósticos de malaria por Plasmodium mediante la amplificación de los primers 18S rRNA. Aunque en un principio se uso una sonda de captura y un sistema de detección por quimioluminiscencia64, la técnica se ha adaptado a tiempo real utilizando el formato con sondas de especies fluorescentes65 con 0,926 de concordancia con la evaluación microscópica de muestras procedentes de viajeros que retornaron de regiones endémicas, siendo la mayoría de las discrepancias, debidas a infecciones mixtas que sólo se detectan por QT-NASBA. La especificidad fue del 100%, y un menor límite de detección (0,002 parásitos/ml) que fue atribuida al alto número de copia del 18S rRNA. QT-NASBA también fue rápida. Los usos de QT-NASBA incluyen aclarar los resultados ambiguos de la microscopía y la identificación de las especies en baja parasitemia65
La QT-NASBA emplea reacciones isotermicas, siendo menos costosa que la instrumentación del PCR en tiempo real66. Sin embargo, QT-NASBA está más allá de la gama de precios de los países endémicos para el uso habitual.
La secuenciación de genomas de patógenos ha generado optimismo en relación con el uso de microchips para el diagnóstico de enfermedades infecciosas. El ADN o ARN aislado de una muestra del paciente se hibridiza con un chip que contiene miles de sondas de oligonucleótidos, cada uno diseñado para reconocer una secuencia de ácido nucleico del patógeno67. Idealmente, estos microchips son miniaturizados y automatizados para el punto de atención de diagnóstico55. Sin embargo, esta tecnología de diagnóstico se encuentra todavía en las primeras etapas de desarrollo.
Hemozoina
La detección de la hemozoina, un producto hema malaria que es ingerido por los monocitos, constituye la base de una prueba para la detección indirecta de malaria. Se usa la propiedad de la hemozoina de depolarizarse con la luz láser. Los analizadores automatizados de hematología con citometria de flujo tienen la capacidad de discriminar monocitos normales de los que han ingerido hemozoina, proporcionando así una indicación de probable infección. Sin embargo, la sensibilidad y especificidad en la actualidad no se compara con la detección con los métodos convencionales. En un estudio, la sensibilidad en una muestra de 58 pacientes diagnosticados con malaria por métodos convencionales estaba limitada a sólo el 62%68. Al igual en otro estudio se revela que la sensibilidad frente a la microscopía varía entre 48.6% y 95%69. Aunque son prometedoras debido a la posibilidad de automatización y rapidez de diagnóstico, este método de detección es actualmente inadecuado para la pesquisa de donantes sobre la base de la falta de sensibilidad.
La espectrometría de masa de desorción láser (LDMS) es una poderosa herramienta para la caracterización molecular. La LMDS es rápida (uno minuto por muestra), de alto rendimiento, y automatizada, y se puede usar con sangre total para diferenciar la hemozoina de los casos de hemo normal. La sensibilidad es alta (10 parásitos/ml), y, en una infección por Plasmodium yoelii modelo murino, LMDS detectó parasitemia tres a cuatro días antes de la microscopía70. El costo y la complejidad del instrumento son prohibitivos, aunque algunos son optimistas con la miniaturización y operación con baterías para hacer esta tecnología viable y asequible para los países en desarrollo71.
Serología
Los anticuerpos contra las cuatro especies de Plasmodium son producidas por casi todos los individuos entre 1 a 14 días después de la infección inicial y se detectan durante meses a años después de la eliminación del parásito72,73.
Un resultado positivo en una prueba a base de anticuerpos, por lo tanto, puede ser indicativo de malaria clínica o subclínica, o de inmunidad en individuos parasitémicos de zonas endémicas. Sin embargo, a pesar de la limitación para la identificacion de la infección activa, las pruebas para la detección de anticuerpos han encontrado aplicaciones en la pesquisa de donantes en riesgo de exposición previa en áreas no-endémicas11,74,75, así como para confirmar la supuesta infección asintomática en donantes no parasitemicos implicados en casos de MTT76
La utilidad de cualquier método basado en anticuerpos depende principalmente de las prevalencia de anticuerpos en la población de donantes. En las zonas endémicas, donde la proporción de individuos con anticuerpos positivos es generalmente entre 20% y 90%77,la pérdida asociada de donantes por los resultados positivos compromete la eficacia de la prueba para efectos de pesquisa.
En poblaciones no endémicas, donde la tasa de anticuerpos positivos entre los donantes identificados como potencialmente expuestos por el interrogatorio es de sólo 1% al 2%,75 la detección de anticuerpos se ha encontrado favorable.
En Francia, por ejemplo, IFAT, en combinación con el interrogatorio sobre viajes se ha utilizado como parte de una estrategia específica de selección desde 1983 y continúa actualmente78. Los donantes que regresan de países donde la malaria es endémica se aplazan inicialmente por 4 meses y luego son probados con IFAT entre cuatro meses y tres años; y si tienen una prueba negativa son reincorporados para donar.
La eficacia de este enfoque en la prevención de MTT es apoyada por la falta de mención de una transmisión entre 1984, cuando fue establecida la denuncia obligatoria de complicaciones de la transfusión, hasta septiembre de 200211
A pesar de la excelente sensibilidad de IFAT, tiene varias limitaciones importantes. En primer lugar, la mayoría de los pruebas se limitan a la deteccion de anticuepos contra P. falciparum con sólo limitada reactividad cruzada para otras especies y, en segundo lugar, la prueba es larga y subjetiva, requiere de conocimientos técnicos para asegurar la reproducibilidad.
En un intento para hacer frente a estas limitaciones, se han desarrollado pruebas a base de anticuerpos EIA específicamente para el tamizaje de donantes de sangre. Inicialmente, estas pruebas se limitaron a detectar anticuerpos contra P. falciparum74 y se investigó la conveniencia de una evaluación con esta prueba de ELISA en donantes expuestos en el Reino Unido. La prueba demostró una excelente sensibilidad del 93% en sueros positivos con IFAT entre 1,5% de los donantes que eran expuestos. La sensibilidad a la infección en 150 muestras de pacientes con extendidos en lámina positivas para malaria - fue del 73% y 52% para P. falciparum y P. vivax, respectivamente. Los autores demostraron que la prueba es lo suficientemente sensible con la condición de que se realice al menos 6 meses después de la última exposición potencial del donante; un tiempo suficiente para el desarrollo de una respuesta de anticuerpos. En apoyo de esta afirmación, citaron tres casos de MTT en el Reino Unido, que probablemente han sido interceptados por la prueba de anticuerpos como una garantía adicional de los donantes potencialmente expuestos identificados por el interrogatorio. El beneficio de este cambio de política se calcula en un ahorro de 40.000 unidades de globulos rojos por año. Se expresó igualmente la preocupación acerca de la dependencia de una prueba restringida a la detección de anticuerpos IgG, así como la baja sensibilidad ante las especies no-falciparum, en particular, P. vivax79,80. A pesar de ello, la prueba se aplicó posteriormente en el Servicio Nacional de Sangre Inglés en 1997 utilizando un enfoque similar al de Francia.
Así, los donantes identificados en situación de riesgo por el interrogatorio se limitan inicialmente a donaciones de plasma durante seis meses. Con la excepción de los definidos como residentes o aquellos con historia de haber padecido malaria, los donantes son sometidos después de seis meses a pruebas de evaluación mediante ELISA y los negativos son reintegrados a la donación.
Un reciente avance en el tamizaje de anticuerpos de los donantes es el desarrollo de EIA multiantigeno utilizando antígenos recombinantes en lugar de nativos. La sensibilidad de P. falciparum y P. vivax ha mejorado notablemente en las últimas pruebas que incorpora en formato sánduche cuatro antígenos recombinantes de P. falciparum y P. vivax, con un rendimiento de la prueba superior al IFAT, la cual se consideró conveniente para los servicios de transfusión en el Reino Unido12. En total, 114 (82,6%) de 138 muestras de pacientes con P. falciparum y 11 (84,6%) de 13 muestras de pacientes con P. vivax resultaron positivas con ELISA, mientras 714 (5,47%) de 13.053 donantes que fueron identificados como "de riesgo de paludismo", por residencia o viaje, se reactivaron con la evaluación por ELISA.
En un estudio realizado por la Cruz Roja Americana, la prueba detectó 106 (98%) de 108 y 12 (100%), de 12 de las muestras de casos positivos por gota gruesa para P. falciparum y P. vivax, respectivamente13
Tras la infección con especies de Plasmodium, la respuesta inmune provoca la formación de anticuerpos específicos. Aunque no necesariamente de protección, no obstante es un indicador eficaz de la infección75, aunque no indica necesariamente que la persona tenga parásitos. Sin embargo, una prueba de anticuerpos contra la malaria negativa no puede garantizar que el donante no esté infectado, ya que los anticuerpos pueden no ser detectables en los primeros días del paludismo, y la infección por P. ovale y P. malariae puede no ser detectada por pruebas basadas en antígenos de P. falciparum y P. vivax.
En un estudio81 donde se examinaron sueros de 415 casos conocidos de malaria diagnosticados en el Reino Unido se llegó a observar que las personas de zonas hiperendémica en África pueden tener altos títulos de anticuerpos reactivos a todos los antígenos, y pueden estar asociados con un bajo grado de infección asintomática que es indetectable microscópicamente; se trata de individuos semi-inmunes que se ha descrito anteriormente.
Es importante señalar que en los individuos que han sufrido repetidos ataques de malaria, los anticuerpos pueden ser detectables durante varios años después de la curación de la infección y ya no son parasitemicos, seguirán siendo excluidos por las pruebas de anticuerpos como posibles donantes.
Aunque durante muchos años, la IFAT es todavía considerada como el "estándar de oro" para la serología de malaria, la más reciente llegada de inmunoensayo enzimático (EIA) usando antígenos recombinantes y nativos ha proporcionado una alternativa más sensible y práctica12, 74
En general, la EIA ha demostrado suficientemente una alta sensibilidad y especificidad para detectar donantes en situación de riesgo.
Bibliografía
1.Boyd M (ed): Epidemiology of malaria. Philidelphia, WB Saunders, 1949
2. Malaria Diagnosis: New Perspectives. Report of a Joint WHO/ USAID Informal Consultation. 2000. World Health Organization. Report no: WHO/CDS/RBM/2000.1 cited 2007 Aug 10; Available from: /http://www.who.int/malaria/diagnosistechnicalreports.htmlS.
3. Milne LM, Kyi MS, Chiodini PL, et al: Accuracy of routine laboratory diagnosis of malaria in the United Kingdom. J Clin Pathol 47:740 - 742, 1994
4. World Health Organization. Severe and complicated malaria, second ed. Trans R Soc Trop Med Hyg, 1990; 84(Suppl. 2): 23–5.
5.Ohrt C, Purnomo A, Sutamihardja MA, Tang D, Kain KC. Impact of microscopy error on estimates of protective efficacy in malaria-prevention trials. J Infect Dis 2002; 186(4): 540–6.
6.Coleman RE, Maneechai N, Rachaphaew N, et al. Comparison of field and expert laboratory microscopy for active surveillance for asymptomatic Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax in western Thailand. Am J Trop Med Hyg 2002; 67(2):141–4.
7.Bosch I, Bracho C, Perez HA: Diagnosis of malaria by acridine orange fluorescent microscopy in an endemic area of Venezuela. Mem Inst Oswaldo Cruz 91:83 - 86, 1996
8.Moody A. Rapid diagnostic tests for malaria parasites. Clin Microbiol Rev 2002; 15(1):66–78.
9.HuongNM, Davis TM, Hewitt S, HuongNV, Uyen TT, Nhan DH, Cong le D: Comparison of three antigen detection methods for diagnosis and therapeutic monitoring of malaria: a field study from southern Vietnam. Trop Med Int Health 2002; 7:304–308.
10.Seed C, Cheng A, Keller A: Comparison of the efficacy of two malarial antibody enzyme immunoassays for targeted blood donor screening. Transfusion 2004; 44:99A [Abstract]
11.Silvie O, Thellier M, Rosenheim M, et al: Potential value of Plasmodium falciparum–associated antigen and antibody detection for screening of blood donors to prevent transfusion transmitted malaria. Transfusion 42:357- 362, 2002
12.Kitchen AD, Lowe PH, Lalloo K, Chiodini PL. Evaluation of a malarial antibody assay for use in the screening of blood and tissue products for clinical use. Vox Sang 2004; 87: 150-5.
13.Seed CR, Cheng A, Davis TM, BoltonWV, Keller AJ, Kitchen A, Cobain TJ. The efficacy of a malarial antibody enzyme immunoassay for establishing the reinstatement status of blood donors potentially exposed to malaria. Vox Sang 2005; 88:98-106).
14.Bell D, Wongsrichanalai C, Barnwell JW. Ensuring quality and access for malaria diagnosis: how can it be achieved? Nat Rev Microbiol 2006; 4(9 Suppl.):S7–S20.
15.Coleman RE, Maneechai N, Rachapaew N, et al. Field evaluation of the ICT Malaria Pf/Pv immunochromatographic test for the detection of asymptomatic malaria in a Plasmodium falciparum/vivax endemic area in Thailand. Am J Trop Med Hyg 2002; 66(4):379–83.
16.Murray CK, Bell D, Gasser RA, Wongsrichanalai C. Rapid diagnostic testing for malaria. Trop Med Int Health 2003; 8(10):876–83.
17.Mason DP, Kawamoto F, Lin K, Laoboonchai A, Wongsrichanalai C. A comparison of two rapid field immunochromatographic tests to expert microscopy in the diagnosis of malaria. Acta Trop 2002; 82(1):51–9.
18.Marx A, Pewsner D, Egger M, et al. Meta-analysis: accuracy of rapid tests for malaria in travelers returning from endemic areas. Ann Intern Med 2005; 142(10):836–46.
19.Farcas GA, Zhong KJ, Mazzulli T, Kain KC. Evaluation of the RealArt Malaria LC real-time PCR assay for malaria diagnosis. J Clin Microbiol 2004; 42(2):636–8.
20.Pieroni P, Mills CD, Ohrt C, Harrington MA, Kain KC. Comparison of the ParaSight-F test and the ICT Malaria Pf test with the polymerase chain reaction for the diagnosis of Plasmodium falciparum malaria in travellers. Trans R Soc Trop Med Hyg 1998; 92(2):166–9.
21.Baker J, McCarthy J, Gatton M, et al. Genetic diversity of Plasmodium falciparum histidine-rich protein 2 (PfHRP2) and its effect on the performance of PfHRP2-based rapid diagnostic tests. J Infect Dis 2005; 192(5):870–7.
22.Craig MH, Bredenkamp BL, Williams CH, et al. Field and laboratory comparative evaluation of ten rapid malaria diagnostic tests. Trans R Soc Trop Med Hyg 2002; 96(3):258–65.
23.Ochola LB, Vounatsou P, Smith T, Mabaso ML, Newton CR. The reliability of diagnostic techniques in the diagnosis and management of malaria in the absence of a gold standard. Lancet Infect Dis 2006; 6(9):582–8.
24.Jorgensen P, Chanthap L, Rebueno A, Tsuyuoka R, Bell D. Malaria rapid diagnostic tests in tropical climates: the need for a cool chain. Am J Trop Med Hyg 2006; 74(5):750–4.
25.Chiodini PL, Bowers K, Jorgensen P, et al. The heat stability of Plasmodium lactate dehydrogenase-based and histidine-rich protein 2-based malaria rapid diagnostic tests. Trans R Soc Trop Med Hyg 2007; 101(4):331–7.
26.Rennie W, Phetsouvanh R, Lupisan S, et al. Minimising human error in malaria rapid diagnosis: clarity of written instructions and health worker performance. Trans R Soc Trop Med Hyg 2007; 101(1):9–18.
27.Bell D, Go R, Miguel C, Walker J, Cacal L, Saul A. Diagnosis of malaria in a remote area of the Philippines: comparison of techniques and their acceptance by health workers and the community. Bull World Health Organ 2001;79(10):933–41
28.Playford EG, Walker J: Evaluation of the ICT malaria P.f/P.v and the OptiMal rapid diagnostic tests for malaria in febrile returned travellers. J Clin Microbiol 40:4166- 4171, 2002
29.Vu TT, Tran VB, PhanNT, et al: Screening donor blood for malaria by polymerase chain reaction. Trans R Soc Trop Med Hyg 89:44 - 47, 1995
30.Benito A, Rubio JM: Usefulness of seminested polymerase chain reaction for screening blood donors at risk for malaria in Spain (letter). Emerg Infect Dis 7:1068, 2001
31.Rickman LS, Jones TR, Long GW, Paparello S, Schneider I, Paul CF, Beaudoin RL, Hoffman SL: Plasmodium falciparum-infected Anopheles stephensi inconsistently transmit malaria to humans. Am J Trop Med Hyg 1990; 43:441–445
32.Timms R, Colegrave N, Chan BHK, Read AF: The effect of parasite dose on disease severity in the rodent malaria Plasmodium chabaudi. Parasitology 2001; 123:1–11
33.Shehata N, Kohli M, Detsky A: The cost-effectiveness of screening blood donors for malaria by PCR. Transfusion 2004; 44:217– 228.
34.Hang VT, Be TV, Tran PN, Thanh LT, Hien LV, O’Brien E, Morris GE: Screening donor blood for malaria by polymerase chain reaction. Trans R Soc Trop Med Hyg 1995; 89:44–47
35.Ndao M, Bandyayera E, Kokoskin E, Gyorkos TW, MacLean JD, Ward BJ: Comparison of blood smear, antigen detection and nested-PCR methods for screening refugees from regions where malaria is endemic after a malaria outbreak in Quebec. Canada. J Clin Microbiol 2004; 42:2694–2700
36.Snounou G, Viriyakosol S, Jarra W, Thaithong S, Brown KN. Identification of the four human malaria parasite species in field samples by the polymerase chain reaction and detection of a high prevalence of mixed infections. Mol Biochem Parasitol 1993; 58(2):283–92.
37.Rubio JM, Benito A, Roche J, et al. Semi-nested, multiplex polymerase chain reaction for detection of human malaria parasites and evidence of Plasmodium vivax infection in Equatorial Guinea. Am J Trop Med Hyg 1999; 60(2):183–7.
38.Humar A, Harrington MA, Kain KC. Evaluation of a non-isotopic polymerase chain reaction-based assay to detect and predict treatment failure of Plasmodium vivax malaria in travellers. Trans R Soc Trop Med Hyg 1997; 91(4):406–9.
39.Zhong KJ, Kain KC. Evaluation of a colorimetric PCR-based assay to diagnose Plasmodium falciparum malaria in travelers. J Clin Microbiol 1999; 37(2):339–41.
40.Calderaro A, Piccolo G, Zuelli C, et al. Evaluation of a new plate hybridization assay for the laboratory diagnosis of imported malaria in Italy. New Microbiol 2004; 27(2):163–71.
41.Speers DJ, Ryan S, Harnett G, Chidlow G. Diagnosis of malaria aided by polymerase chain reaction in two cases with low-level parasitaemia. Intern Med J 2003; 33(12):613–5.
42.Blossom DB, King CH, Armitage KB. Occult Plasmodium vivax infection diagnosed by a polymerase chain reaction-based detection system: a case report. Am J Trop Med Hyg 2005; 73(1):188–90.
43.Singh B, Cox-Singh J, Miller AO, Abdullah MS, Snounou G, Rahman HA. Detection of malaria in Malaysia by nested polymerase chain reaction amplification of dried blood spots on filter papers. Trans R Soc Trop Med Hyg 1996; 90(5):519–21.
44.Mangold KA, Manson RU, Koay SC, Stephens L, Regner M, Thomson RB, Peterson LR, Kaul KL. Real-time PCR for detection and identification of Plasmodium spp. J Clin Microbiol 2005; 43:2435-40.
45.Rougemont M, Van Saanen M, Sahli R, Hinrikson HP, Bille J, Jaton K. Detection of four Plasmodium species in blood from humans by 18S rRNA gene subunit-based and species-specific real-time PCR assays. J Clin Microbiol 2004; 42(12):5636–43.
46.Perandin F, Manca N, Calderaro A, et al. Development of a real-time PCR assay for detection of Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, and Plasmodium ovale for routine clinical diagnosis. J Clin Microbiol 2004; 42(3):1214–9.
47.de Monbrison F, Angei C, Staal A, Kaiser K, Picot S. Simultaneous identification of the four human Plasmodium species and quantification of Plasmodium DNA load in human blood by real-time polymerase chain reaction. Trans R Soc Trop Med Hyg 2003; 97(4):387–90.
48.Swan HSL, Muyombwe A, Chavalitshewinkoon-Petmitr P, Krudsood S, Leowattana W, Wilairatana P, et al. Evaluation of a real-time polymerase chain reaction assay for the diagnosis of malaria in patients from Thailand. Am J Trop Med Hyg 2005; 73(5):850–4.
49.Kain KC, Kyle DE, Wongsrichanalai C, et al. Qualitative and semiquantitative polymerase chain reaction to predict Plasmodium falciparum treatment failure. J Infect Dis 1994; 170(6):1626–30.
50.Jarra W, Snounou G. Only viable parasites are detected by PCR following clearance of rodent malarial infections by drug treatment or immune responses. Infect Immun 1998; 66(8): 3783–7.
51.Bialasiewicz S, Whiley DM, Nissen MD, Sloots TP. Impact of competitive inhibition and sequence variation upon the sensitivity of malaria PCR. J Clin Microbiol 2007; 45(5):1621–3.
52.Calderaro A, Piccolo G, Perandin F, et al. Genetic polymorphisms influence Plasmodium ovale PCR detection accuracy. J Clin Microbiol 2007; 45(5):1624–7.
53.Vo TK, Bigot P, Gazin P, et al. Evaluation of a real-time PCR assay for malaria diagnosis in patients from Vietnam and in returned travellers. Trans R Soc Trop Med Hyg 2007; 101(5):422–8.
54.Yang S, Rothman RE. PCR-based diagnostics for infectious diseases: uses, limitations, and future applications in acutecare settings. Lancet Infect Dis 2004; 4(6):337–48.
56.Djimde AA, Dolo A, Ouattara A, Diakite S, Plowe CV, Doumbo OK. Molecular diagnosis of resistance to antimalarial drugs during epidemics and in war zones. J Infect Dis 2004; 190(4):853–5.
57.Agrawal N, Hassan YA, Ugaz VM. A pocket-sized convective PCR thermocycler. Angew Chem Int Ed Engl 2007; 46(23):4316–9.
58.Shekalaghe SA, Bousema JT, Kunei KK, et al. Submicroscopic Plasmodium falciparum gametocyte carriage is common in an area of low and seasonal transmission in Tanzania. Trop Med Int Health 2007; 12(4):547–53.
59.John CC, McHugh MM, Moormann AM, Sumba PO, Ofulla AV. Low prevalence of Plasmodium falciparum infection among asymptomatic individuals in a highland area of Kenya. Trans R Soc Trop Med Hyg 2005; 99(10):780–6.
60.Coleman RE, Sattabongkot J, Promstaporm S, et al. Comparison of PCR and microscopy for the detection of asymptomatic malaria in a Plasmodium falciparum/vivax endemic area in Thailand. Malar J 2006; 5:121.
61.Swan H, Sloan L, Muyombwe A, et al. Evaluation of a real-time polymerase chain reaction assay for the diagnosis of malaria in patients from Thailand. Am J Trop Med Hyg 2005; 73(5):850–4.
62.Poon LL, Wong BW, Ma EH, et al. Sensitive and inexpensive molecular test for falciparum malaria: detecting Plasmodium falciparum DNA directly from heat-treated blood by loop mediated isothermal amplification. Clin Chem 2006; 52(2): 303–6.
63.Han ET, Watanabe R, Sattabongkot J, et al. Detection of four Plasmodium species by genus- and species-specific loop mediated isothermal amplification for clinical diagnosis. J Clin Microbiol 2007; 45(8):2521–8.
64.Schoone GJ, Oskam L, Kroon NC, Schallig HD, Omar SA. Detection and quantification of Plasmodium falciparum in blood samples using quantitative nucleic acid sequence-based amplification. J Clin Microbiol 2000; 38(11):4072–5.
65.Mens PF, Schoone GJ, Kager PA, Schallig HD. Detection and identification of human Plasmodium species with real-time quantitative nucleic acid sequence-based amplification. Malar J 2006; 5:80.
66.Lanciotti RS, Kerst AJ. Nucleic acid sequence-based amplification assays for rapid detection of West Nile and St. Louis encephalitis viruses. J Clin Microbiol 2001; 39(12):4506–13.
67.Gilbert GL. Molecular diagnostics in infectious diseases and public health microbiology: cottage industry to postgenomics. Trends Mol Med 2002; 8(6):280–7.
68.Wever PC, Henskens YM, Kager PA, et al: Detection of imported malaria with the Cell-Dyn 4000 hematology analyzer. J Clin Microbiol 40:4729- 4731, 2002
69.Grobusch MP, Hanscheid T, Kramer B, et al. Sensitivity of hemozoin detection by automated flow cytometry in non- and semi-immune malaria patients. Cytometry B Clin Cytom 2003; 55(1):46–51.
70.Scholl PF, Kongkasuriyachai D, Demirev PA, et al. Rapid detection of malaria infection in vivo by laser desorption mass spectrometry. Am J Trop Med Hyg 2004; 71(5):546–51.
71.Mann M. Mass tool for diagnosis. Nature 2002; 418(6899): 731–2.
72.Contreras CE, Pance A, Marcano N, et al: Detection of specific antibodies to Plasmodium falciparum in blood bank donors from malaria-endemic and non-endemic areas of Venezuela. Am J Trop Med Hyg 60:948 - 953, 1999
73.Park CG, Chwae YJ, Kim JI, et al: Serologic responses of Korean soldiers serving in malaria-endemic areas during a recent outbreak of Plasmodium vivax. Am J Trop Med Hyg 62:720 - 725, 2000
74.Chiodini PL, Hartley S, HewittPE, Barbara JAJ, Lalloo K, Bligh J, Voller A: Evaluation of a malaria antibody ELISA and its value in reducing potential wastage of red cell donations from blood donors exposed to malaria, with a note on a case of transfusion transmitted malaria. Vox Sang 1997; 73:143–148
75.Davidson N, Woodfield G, Henry S: Malarial antibodies in Auckland blood donors. N Z Med J 112:181 - 183, 1999
76.Mungai M, Tegtmeier G, Chamberland M, Parise M. Transfusion-transmitted malaria in the United States from 1963 through 1999. N Engl J Med 2001; 344:1973-8.
77.Akinboye DO, Ogunrinade AF: Malaria and loaisis among blood donors at Ibadan, Nigeria. Trans R Soc Trop Med Hyg 81:398 - 399, 1987
78.Courtois F, Farragi M, Richard-Lenoble D, et al: Trial routine detection of malaria: Experimentation of 1500 donors. Rev Fr Transfus Immunohematol 19:357 - 361, 1976
79.Mertens G, Vervoort T, Heylen S, et al: Malaria antibody ELISA insufficiently sensitive for blood donor screening. Vox Sang 77:237 - 238, 1999
80.Gillon J: Introduction of malaria antibody ELISA. Vox Sang 75:80 - 81, 1998
81.Draper C, Sirr SS: Serological investigations in retrospective diagnosis of malaria. BMJ 1980; 1575–1576.
