12.04.2010

Consultas al Experto del Mes de Septiembre 2010




CONSIDERACIONES SOBRE EL TAMIZAJE SEROLOGICO EN DONANTES DE SANGRE


PROFESOR INVITADO: Dr Amadeo Sáez-Aquezar
Asesor Nacional del Programa de Control de Calidad, formando parte de la Sociedad Brasilera de Análisis Clínico.  amadeo62@gmail.com










Introducción

El objetivo del tamizaje para enfermedades infecciosas en donantes de sangre es evitar la transmisión de enfermedades transmisibles a los receptores de sangre y componentes sanguíneos. En general y principalmente en todos los países de Latinoamérica se utiliza el tamizaje serológico que debe ser obligatorio para HIV, Hepatitis B (HBV), Hepatitis C (HCV), Sífilis y anti-T.cruzi.

Dependiendo de las características epidemiológicas de cada país o región, otros tests pueden ser usados en el tamizaje. De esta manera, el tamizaje para el HTLV es realizado en países con prevalencia significativa  para el virus. También la evaluación de la malaria puede tener interés en regiones con alta prevalencia o en regiones sin transmisión activa en las que se desea evitar la transmisión a través de las donaciones de viajeros provenientes de áreas con transmisión activa. 

Con respecto al HIV, HBV y HCV, lo ideal sería asociar tests NAT (Nucleic acid amplification Technology) al tamizaje serológico, para disminuir el riesgo de transmisión por transfusión, porque se consigue acortar el período de la ventana inmunológica. Esos tests son utilizados en muestras individuales o en “mini-pools” y actualmente existen técnicas llamadas multiplex que consiguen detectar DNA y RNA de distintos virus, simultáneamente.

Aunque la importancia del uso de tests NAT junto con el tamizaje serológico está ampliamente comprobada, debido a problemas principalmente económicos y de infra estructura, hasta el momento no ha sido posible implementarlos en todos los bancos de sangre de Latinoamérica.  En algunos países se utilizan los tests NAT en  instituciones aisladas.

De tal forma, consideramos que en nuestra región de Latinoamérica se deben reforzar los procedimientos de tamizaje serológico, que han de obedecer a criterios rígidos para que puedan ser lo más eficaces posible y aún así tienen sus limitaciones que deben ser bien conocida.

En la figura 1. Se pueden visualizar las pruebas de laboratorio disponibles para el tamizaje de donantes de sangre.

Parámetros
Tests Serológicos
NAT
HIV
Anti-HIV
HIV Ac / Ag p24
HIV - RNA
HTLV
Anti-HTLV

HBV
AgHBs
Anti-HBc
HBV - DNA
HCV
Anti-HCV
HCV Ac /Ag core
HCV - RNA
CHAGAS
Anti-T.cruzi

SÍFILIS
VDRL / RPR
Anti-T.pallidum

Figura 1. Tests Serológicos que pueden ser usados en el Tamizaje de donantes de sangre

Tamizaje serológico

Algunos temas relacionados con el tamizaje serológico son de extrema importancia de modo que pasaremos a hacer algunas consideraciones sobre ellos, en el sentido de recordar y/o actualizar conceptos logísticos y técnico-científicos.

Normas Nacionales y selección de donantes: La Organización Mundial de la Salud (OMS) recomienda, que cada país deba tener normas nacionales que reglamenten el tamizaje serológico para enfermedades transmisibles por transfusión en donantes de sangre total y por aféresis. Dentro de las normas oficiales que definen los parámetros que serán obligatorios en el tamizaje de donantes de sangre, todavía existe la posibilidad de aplicar tests con características especiales o asociar a otros tests, para hacer el tamizaje más eficaz. Otro aspecto importante es que los países tengan un laboratorio de referencia para evaluar los kits diagnósticos como pre requisito para la comercialización de los productos.

Selección de donantes: Entre los países de Latinoamérica encontramos tres tipos de donantes: Voluntarios altruistas no remunerados, voluntarios de reposición y donantes remunerados. En la mayoría de los países predominan los donantes voluntarios de reposición, según datos de la Organización Panamericana de la Salud (OPS) y en algunos países como en Honduras, Panamá, Perú y República Dominicana todavía persiste un porcentaje de donantes remunerados. Diversos estudios demuestran que el riesgo para transmitir infecciones vía transfusión sanguínea puede ser hasta 4 veces mayor en donantes voluntarios de reposición cuando son comparados con donantes voluntarios altruistas no remunerados. Con donantes remunerados el riesgo puede ser mucho mayor. Nunca es demasiado insistir en que se aumenten las acciones para aumentar el número de donantes voluntarios altruistas no remunerados de repetición para asegurar una mejor calidad de la sangre.  La selección de donantes junto con el tamizaje son las etapas estratégicas de mayor interés para poder suministrar componentes sanguíneos con menor riesgo para la transfusión.

Confirmación de los resultados del tamizaje serológico: Aunque en la mayoría de los países, la confirmación de los resultados no es obligación de los bancos de sangre,  consideramos que debe ser realizada (interna o externamente) con el fin de poder orientar correctamente a los donantes y direccionarlos, cuando sea necesario, a servicios de apoyo y seguimiento ambulatorio. Esa logística no es solamente científicamente correcta sino éticamente indispensable.

Características de los tests serológicos y estrategias de tamizaje

Los tests serológicos que se van a usar en el tamizaje serológico de donantes de sangre deben tener la mayor sensibilidad posible para evitar resultados falsos negativos y al  mismo tiempo la mejor especificidad posible para evitar resultados falsos positivos. Por mejor que sea la sensibilidad de los tests serológicos para los virus HIV, HCV y HBV hemos de considerar el período de ventana inmunológica, la posibilidad de que los antígenos o anticuerpos estén en bajos títulos y las variantes virales que pueden no ser detectadas por algunos tests.

En los últimos años hemos podido observar en mayor proporción el uso de inmunoensayos tipo ELISA y la substitución gradual de tests de HA, IFI y floculación, debido a problemas referentes a la lectura visual (subjetiva) y al gran número de resultados falsos positivos y falsos negativos que se generaban. Hoy en día hay una tendencia para utilizar tests por quimioluminiscencia (CLIAs) que en verdad presentan la misma sensibilidad y especificidad de los tests ELISA. Las características de ambos son similares, cambiando únicamente la manera de detectar los inmuno complejos formados al final de las reacciones. 

Tests rápidos, por aglutinación de partículas o por inmunofiltración no se prestan para rutinas con gran número de muestras y tienen el inconveniente de que la lectura es visual y por eso no se aconsejan para las rutinas de tamizaje serológico de donantes de sangre. En general la sensibilidad de esos tests es inferior a los ELISAs o CLIAs.

Tests rápidos tampoco son la mejor opción para el tamizaje serológico pero pueden ser utilizados en situaciones de emergencia o en rutinas con pequeño número de muestras en regiones en que no exista la estructura básica de un laboratorio.  

Debemos dar atención especial para algunas características específicas de cada parámetro, cómo la prevalencia, los tipos de tests disponibles, las mejores estrategias y los procedimientos de control de calidad adecuados.

HIV

El HIV (virus de la inmunodeficiencia Humana) es un retrovirus con genoma constituido por RNA. Se conocen 2 tipos de HIV: HIV-1 y HVI-2.  El HIV-1 es responsable por las infecciones en la mayor parte del planeta al paso que el HIV-2 está presente principalmente en África e India.  El HIV-1 tiene varios grupos (M, N, O y P) siendo que el grupo M (mayor) es responsable de más del 99% de las infecciones en el mundo. Cada grupo presenta, subtipos y sub-subtipos. Los tests de laboratorio para diagnóstico de la infección por HIV han de llevar en consideración algunas características especiales que pueden estar presentes en cada variante. Por ejemplo,  en los años 1990 se pudo verificar que algunos tests no conseguían detectar reactividad en muestras de pacientes infectados con el grupo “O” del HIV-1. Eso llevó al desarrollo de tests con péptidos sintéticos de la región gp41 del HIV-1 “O” que solucionó el problema. En los últimos años se ha verificado también el surgimiento de formas recombinantes entre tipos y sub-tipos del HIV que surgen por la infección simultánea o en períodos distintos de células que dan origen a virus heterocigotos y finalmente a virus recombinantes con genomas modificados. Esas formas están presentes en muchas regiones del planeta y son denominadas como formas recombinantes circulantes (CRFs). Es muy importante que las empresas productoras de kits diagnósticos verifiquen la capacidad que los kits diagnósticos tienen para detectar no solo los tipos y sub-tipos del HIV sino también esas CRFs.

Los tests serológicos para el diagnóstico y tamizaje del HIV han evolucionado en los últimos años como podemos verificar en la figura 2.
Generación
Principio
Ventana
Fracciones
1ª y 2ª
Detección de Ac IgG
2ª G: proteínas purificadas
4 – 12 semanas
Lisado Viral
Ag rec
Detección de Ac IgG e IgM
3 – 4 semanas
a)env y gag del HIV1 rec
b)gp160 y p24 purificadas + PS de la región gp41 del HIV-1”O” + gp36 del HIV2
Utilizan un Ac para detectar el Ag “p24” – “combo”
2 semanas
Gp 160 + Ag p24 del HIV1+ PS de la región gp41 del HIV-1”O”
+ gp36 del HIV2
Figura 2.  Evolución de los tests ELISA para diagnóstico del HIV


Los tests serológicos más utilizados en los últimos 10 años  para el tamizaje de HIV han sido tests inmunoenzimáticos, principalmente por ELISA y en menor proporción por MEIA y CLIA.  Esos tests se pueden clasificar en tres categorías.  Los que detectan anticuerpos contra los tipos 1 y 2 del HIV  (anti-HIV1+2),  los que detectan anticuerpos contra los tipos 1 y 2 y grupo “O” del HIV-1  (anti-HIV1+2+”O”)  y los que detectan anticuerpos para el HIV (generalmente tipos 1 y 2 + “O”) y el antígeno p24  (HIV Combinación Ag/Ac). Utilizando los tests de 3ª generación para detección de anticuerpos contra el HIV, el período de ventana inmunológica es, en promedio, de 22 días. Si utilizamos el test HIV Ag/Ac conseguimos acortar ese período de ventana en alrededor de 4 a 5 días, lo que representa una opción importante en bancos de sangre, principalmente cuando no se realizan los tests NAT. El HIV – RNA se detecta alrededor de 7 a 11 días después de la infección.

En Brasil, desde 2002, las normas oficiales obligan a utilizar dos tests con fundamentos distintos en el tamizaje de donantes de sangre. Aunque no exista ninguna recomendación para el uso específico de tests HIV Ag/Ac, desde 2008 más del 80% de los servicios de hemoterapia utiliza un test HIV Ag/Ac en el tamizaje. 
Actualmente los tests recomendados son de 3ª generación anti-HIV 1+2+”O” y los tests “combo” HIV Ag/Ac de 4ª generación.  Con los tests de 3ª generación el período de ventana es alrededor de 22 días. Con los tests de 4ª generación se consigue disminuir ese período en 4 o 5 días.

Para confirmar los resultados repetidamente reactivos de los tests de tamizaje se emplea el test de Western blot (WB), pero lo correcto es extraer una nueva muestra de sangre para repetición de los tests del tamizaje y entonces aplicar el WB.  En casos de duda se realiza un test de biología molecular HIV-RNA cuantitativo.
Los tests usados para tamizaje del HIV deben tener Sensibilidad  Analítica  alta y Sensibilidad Clínica alta y además tener capacidad para detectar distintos tipos, subtipos, sub-subtipos y CRFs .

HTLV
 
El HTLV (virus linfotrópico de las células T humanas) es un retrovirus con genoma constituido por RNA. Además del HTLV-1, descubierto en 1980 y del HTLV-2 descubierto en 1982, recientemente fueron reportados otros dos tipos: HTLV-3 y HTLV-4.

El diagnóstico clínico de la infección por el HTLV 1 y 2 todavía está basada principalmente en tests serológicos (ELISA y Western blot). De la misma manera que para el HIV los tests para diagnóstico y tamizaje del HTLV  han mejorado en los últimos años como puede ser evidenciado en la figura 3. 

La mejoría del desempeño de los ensayos serológicos para el diagnóstico del HTLV  han sido benéficos para el control de las enfermedades relacionadas con el HTLV y se espera que futuros ajustes puedan ayudar en el diagnóstico y la confirmación de casos de infección por los tipos 3 y 4.

Generación
Características
Lisado viral – Ac marcados – Baja especificidad
Ag recombinantes / Ac marcados – especificidad mejorada
3ª y 4ª
Ag rec – PS / Ag marcados – Alta sensibilidad y especificidad
PS (gp46-1 y gp46-2) + GD 21
PS + GP 21 rec
Ag correspondientes marcados
Figura 3.  Evolución de los tests ELISA para HTLV.  PS: péptidos sintéticos; rec: proteínas recombinantes

Para el tamizaje serológico se recomienda usar tests de 3ª o 4ª generación. Muestras con resultados repetidamente reactivos se pueden confirmar con tests Western blot o Inmuno blot que en muchos casos, no en todos, consiguen determinar el tipo de HTLV. Para la confirmación de los resultados repetidamente reactivos del tamizaje, siempre es fundamental extraer una nueva muestra para repetir los tests iniciales y entonces aplicar el test de WB. En algunas situaciones puede ser necesario realizar un test de biología molecular para definir el tipo de HTLV o para confirmar el resultado. En esos casos se debe extraer una nueva muestra de sangre total para procesarla adecuadamente, direccionada a los tests de biología molecular.

Actualmente los servicios de hemoterapia que ejecutan el tamizaje para HTLV lo hacen usando un test Inmunoenzimático (ELISA o CLIA).

Se debe dar preferencia a los tests que contengan fracciones antigénicas específicas para el HTLV-1 y HTLV-2.  Los test que presentan mejor sensibilidad y especificidad son los de 3ª y 4ª generación porque esos utilizan antígenos marcados en el conjugado y de esa manera eliminan el segundo anticuerpo que era la principal causa de resultados falsos positivos. Además son capaces de detectar anticuerpos tipo IgA, IgG e IgM.

HBV

El HBV (virus de la hepatitis B) pertenece al grupo hepadnavirus y tiene un genoma constituido por DNA. Durante el curso de la infección por el HBV surgen diversos marcadores serológicos que son usados para el diagnóstico y el seguimiento de los pacientes.  

El primer marcador serológico a ser detectado (después del HBV – DNA) en el curso de la infección es el antígeno de superficie (Ag HBs) que corresponde al envoltorio del virus. En los casos de evolución para la cura, los niveles plasmáticos del AgHBs desaparecen en un periodo inferior a 6 meses, surgiendo el Anti-HBs  que representa la recuperación serológica. En los casos que ocurre evolución para infección crónica, los niveles de Ag HBs persisten después de seis meses, de la misma forma que el HBV-DNA.  

Otro marcador de interés es el anti-HBc que al principio de la infección es del tipo IgM y que después está presente en la forma de IgG.  Teóricamente,  el anti-HBc (IgG) está presente en todos los individuos infectados por el HBV, independientemente de la evolución de la infección.

El HBV presenta diversas variantes representadas como subtipos, genotipos y mutantes. Los subtipos corresponden a combinaciones distintas entre determinantes antigénicos (a, d, w, y, r). Los más comunes son adw, adr, ayw.  Es importante notar que el determinante antigénico “a” está presente en todos los subtipos. La clasificación en genotipos (A, B, C, D, H, G,…) está basada en la divergencia genética del 8% o más, de la secuencia completa de nucleótidos.  Tanto los subtipos como los genotipos se originan de forma natural durante el curso de la infección, están consolidados en la naturaleza y presentan distribución étnica y geográfica características. La otra forma de variantes del HBV son las mutaciones que son generadas espontáneamente durante el curso de la infección por el HBV o por un ambiente de presión selectiva debida al uso de profilaxis activa o pasiva y uso de antivirales.

Esas mutaciones pueden ocurrir en diversas regiones del virus pero aquellas que surgen en el gen S y modifican los epítopos inmunodominantes del determinante antigénico “a”, en muchos casos pueden crear problemas en la detección del AgHBs por los tests diagnósticos tradicionales.  En Regiones donde se adoptó la vacunación contra el HBV, el porcentaje de esas mutaciones puede ser de 2% o mayor.

Para interrumpir la trasmisión por transfusión del virus de la hepatitis B (HBV) existen dos estrategias para el tamizaje. Utilizar únicamente el test para detectar el Ag HBs o utilizar concomitantemente el test para detectar el anti-HBc (IgG o total).  Diversos estudios en la literatura internacional demuestran que es más seguro utilizar el test de anti-HBc, junto con el AgHBs,  para eliminar el riesgo residual de transmisión del HBV.  Todavía la introducción del segundo test depende, en primer lugar de las normas de cada país y también del presupuesto del gobierno o de las instituciones. Por supuesto que el descarte de unidades de sangre es mayor cuando se utiliza el anti-HBc lo que significa una pérdida de donantes y crea algunas dificultades para comunicar a los donantes que sean rechazados por haber presentado reactividad solamente para el anti-HBc. Al mismo tiempo se han descrito muchos casos de hepatitis B oculta en que el AgHBs presenta resultados no reactivos y el único marcador de la infección por el HBV puede ser el anti-HBc, principalmente en el caso de mutantes en el determinante “a” del HBV, en que algunos tests para AgHBs no consiguen detectar el estado de infección. Otra posibilidad es cuando los niveles plasmáticos del AgHBs son muy bajos y los tests de tamizaje no consiguen detectarlos.

También hemos de considera que algunos resultados anti-HBc positivos corresponden a individuos con infección anterior por el HBV que tuvieron recuperación serológica (desaparecimiento del AgHBs)  y que después de años, el anti-HBs se quedó en niveles muy bajos, indetectables por los tests serológicos. Tampoco podemos excluir la posibilidad de que un resultado anti-HBc positivo, con AgHBs y anti-HBs negativos corresponda a un Resultado Falso Positivo. A ese respecto, podemos comentar que la performance de los kits diagnósticos para detección de anti-HBc ha sido bastante variable, de modo que en muchos casos no se puede obtener el mismo resultado cuando se usan tests de distintas procedencias en la misma muestra. 

Existen recomendaciones de agencias internacionales para que los kits para detección de Ag HBs presenten una sensibilidad analítica alta (< 0,13 UI/mL) y que consigan detectar el mayor número de mutantes posible. De la misma manera, sería importante considerar que los tests para anti-HBc, también deberían requerir de una estandarización para que los resultados obtenidos por distintos kits comerciales puedan ser comparables.

Como ha sido comentado anteriormente, cuando se utiliza el test de anti-HBc en el tamizaje, el descarte de unidades de sangre es más alto. En regiones no-endémicas para la infección por el HBV el descarte en donantes de sangre puede variar entre el 2% al 5%.  En regiones endémicas ese descarte puede ser mucho mayor llegando al hasta el 20%. Eso ha sido un motivo de preocupación pues debido al descarte por el anti-HBc en regiones endémicas puede haber escasez de donantes creando un problema serio de abastecimiento. Algunas publicaciones han propuesto alternativas para poder utilizar donantes anti-HBc positivos, como por ejemplo tomar la decisión en función del título de anticuerpos anti-HBs.  Esas alternativas no deben ser adoptadas. Si una muestra resulta en resultado reactivo para el anti-HBc, la unidad de sangre correspondiente no deberá ser utilizada.

En áreas endémicas con alta prevalencia de anti-HBc es recomendable intentar conseguir un grupo de donantes voluntarios de repetición para superar el problema de falta de donantes. Una alternativa seria vacunar contra el HBV los donantes que presentan reactividad solamente para el anti-HBc. Si ocurre seroconversión (anti-HBs positivo) podemos considerar que el individuo no había entrado en contacto anteriormente con el HBV y que el resultado del anti-HBc fue un resultado falso positivo.

En situaciones extremas, cuando hay escasez de sangre en áreas de alta prevalencia, es preferible importar sangre de otras regiones que no utilizar donantes con anti-HBs reactivo.
En la figura 4 se pueden ver algunas características de los tests usados para el tamizaje de HBV.

Parámetro
Características
Ag HBs
Sensibilidad
1- Detección de < 0,13 UI/mL
2- Detección del mayor número de mutantes y genotipos
Especificidad
≥ 99,5 %

Importancia
Anti-HBc (IgG o total)
Eliminar el riesgo residual de transmisión del HBV
1-     Tests Ag HBs con baja sensibilidad
2-     Niveles de Ag HBs indetectables
3-     Mutantes en el determinante “a” del HBV
4-     Hepatitis oculta
Figura 4 Tests usados en el tamizaje serológico para interrumpir la transmisión del HBV por transfusión

Para confirmar las muestras repetidamente reactivas para el AgHBs en general se utiliza un test de neutralización, pero llevando en consideración que solo muestras con lecturas relativamente elevadas, permiten obtener un resultado definitivo con ese test.

En el caso de muestras con lecturas próximas al valor de corte o cuando se quiere una confirmación definitiva, se recomienda usar un test de biología molecular HBV-DNA.

La confirmación de muestras anti-HBc repetidamente reactivas es un poco más complicado. Si el resultado de la muestra es negativo para el AgHBs, se recomienda realizar el test para anti-HBs. Si es reactivo estará de acuerdo con el resultado del Anti-HBc. Si es negativo, solamente un test de biología molecular HBV-DNA puede dar una indicación del significado real del anti-HBc reactivo.

HCV
El HVC (virus de la hepatitis C) pertenece al grupo flavivirus y tiene un genoma constituido por RNA.
La evolución de los tests serológicos para el diagnóstico y tamizaje del HCV se pueden visualizar en la figura 5.


Generación
Ventana
Fracciones antigénicas
150 días
NS4
82 días
Core + NS3 + NS4
66 días
Core + NS3 + NS4 + NS5
Ac IgG e IgM;  Distintas variantes virales
± 39 días
Core + NS3 + NS4  +  Ac para detectar Ag “core”
Figura 5.  Evolución de los tests ELISA para diagnóstico y tamizaje de la infección por HCV

Los tests más usados para el tamizaje serológico continúan siendo ELISAs y en menor proporción MEIAs y CLIAs.

Los valores, en días, referentes a la ventana inmunológica cuando se utilizan tests de 3ª y de 4ª generación han sido escogidos entre distintos datos presentados en la literatura.  En verdad todavía hay muchas dudas acerca del comportamiento efectivo de los tests para detectar anticuerpos en la evolución de la infección por el HCV.

De forma parecida con el HIV, actualmente existen tests “combo” que detectan la presencia de anticuerpos y del antígeno “core” del HCV. Esos tests consiguen disminuir el período de ventana inmunológica en relación a los tests que detectan solamente anticuerpos. Como el tamizaje para HCV se hace utilizando un único test, el porcentaje de bancos que han adoptado los tests combo todavía es poco significativo (menor que el 50%), a pesar de sus características de encortar el período de ventana. Más estudios comparativos entre los tests para detección de anticuerpos y los tests combo tal vez puedan ayudar a entender mejor las ventajas o desventajas de ese cambio de estrategia. En verdad tanto los tests anti-HCV como HCV Ag/Ac han mostrado problemas de especificidad lo que dificulta la comparación entre ellos. Aceptando que la especificidad es similar entre los tests, y que la sensibilidad para detectar anticuerpos anti-HCV también es similar, entonces la mejor opción sería utilizar los tipo combo en el tamizaje por la disminución del período de ventana.

Para el tamizaje en bancos de sangre se recomienda El uso de tests ELISAs o CLIAs de 3ª o de 4ª generación. El uso de tests tipo Western blot o Inmuno blot para confirmar resultados repetidamente reactivos en muestras de donantes, es una alternativa cara que resulta en muchos resultados indeterminados. Una alternativa más adecuada consiste en extraer una nueva muestra del donante, para repetir la serología y hacer un test HCV RNA cualitativo que es extremamente sensible.

Sífilis

La sífilis es una enfermedad infecciosa causada por el Treponema pallidum que puede ser transmitida por transfusión sanguínea.

Desde 1966 ningún caso de sífilis póst-transfusional ha sido reportado en la literatura científica. Aun así, hasta hoy, se continúa haciendo el tamizaje en donantes. Algunos puntos se han de llevar en consideración sobre ese tema:
a)    Parece que el T.pallidum en bolsas de sangre conteniendo citrato y almacenadas entre 4º y 8º C por 72 h pierde la viabilidad.
b)    En algún momento se pensó que el tamizaje para sífilis podría ser un marcador indirecto para la infección por HIV, pero esa hipótesis fue rechazada.
c)    No fue confirmado el DNA del T.pallidum en muestras positivas para sífilis (confirmadas) de donantes de sangre.
d)    Parece que el mayor riesgo de transmisión de la infección por T.pallidum ocurre  en la transfusión de plaquetas, donde el plazo para utilización es menor, la concentración de citrato es más baja y la temperatura de almacenamiento es mayor (22º C).
e)     Informaciones recientes indican que el número de personas infectadas por el Treponema pallidum está creciendo, principalmente entre personas jóvenes, lo que sería un dato a más para justificar el tamizaje en bancos de sangre.

Los tests serológicos para diagnóstico y tamizaje de sífilis pueden ser de dos tipos: Treponémicos  y no-treponémicos o cardiolipínicos. En la figura 6 podemos visualizar esos tests.

Figura 6.  Tests serológicos para diagnóstico y tamizaje de sífilis
Tests Treponémicos
Hemaglutinación (TPHA)
ELISA
FTA abs (IFI)
Western blot (WB)
Tests rápidos (TR)
Hematíes sensibilizados con Ag recombinantes o lisado de T.pallidum
IgG + IgM o solo IgM
Método confirmatorio para la infección por T.pallidum*
Fracciones: TmpA, Tmp37, Tmp17 y Tmp15
Inmunocromatografía
Tests No-Treponémicos
VDRL
USR
TRUST
RPR
Venereal Diseases Research Laboratory
Unheated Serum Reagin
Toluidine Red Unheated Serum Test
Rapid Plasma Reagin
(*)El FTA abs (referencia) está siendo substituido por otros tests: TPHA, WB , ELISA

La sensibilidad de los tests ELISA (IgG+IgM) y del TPHA es igual o superior a la sensibilidad de los tests no-treponémicos (VDRL/ RPR) tanto en la fase primaria como en las demás fases de la infección.

El tamizaje serológico para sífilis se realiza, en mayor proporción, a través de tests no-treponémicos (VDRL, RPR) y en menor proporción por tests treponémicos (anti-T.pallidum ELISA).

Los principales motivos para el uso de tests no-treponémicos son el bajo costo y el menor descarte de bolsas.
Cuando se utiliza un test no-treponémico en el tamizaje es importante que se haga el test en duplicado: una muestra pura y otra con dilución de 1/10, para evitar el fenómeno de pro-zona que cuando la concentración de anticuerpos es muy elevada puede dar resultados falsos negativos en muestras sin dilución.

Los tests treponémicos detectan anticuerpos específicos contra el T.pallidum al paso que los tests No-Treponémicos no son específicos para la infección por T.pallidum.
 
Tests treponémicos presentan reactividad en personas que tuvieron infección por el T.pallidum,  pasada o reciente y que fueron, tratadas o no.

Los tests no treponémicos son extremamente útiles para el seguimiento terapéutico.

Para el tamizaje serológico en donantes de sangre la OMS recomienda el uso de tests Treponémicos de alta sensibilidad y especificidad como TPHA o ELISA.

En poblaciones donde se observa una alta incidencia de sífilis la OMS considera la posibilidad de  usar tests no treponémicos como el  VDRL o el RPR en el tamizaje.

También existe la posibilidad de usar un test treponémico junto con un test no-treponémico en el tamizaje de donantes de sangre.

Para confirmar los resultados reactivos de los tests serológicos para sífilis, la recomendación todavía sigue siendo realizar un test de IFI (FTA abs). En nuestra opinión tests de WB e incluso de TPHA son más adecuados para confirmar los resultados de sífilis.

Chagas

La enfermedad de Chagas es causada por el parásito Trypanosoma cruzi y puede ser transmitida por transfusión sanguínea y por el trasplante de órganos.  El tamizaje de donantes para Chagas que estaba restricto al área de los países endémicos de Latinoamérica, se extiende ahora a otros países no endémicos, pero con número significativo de inmigrantes provenientes de países endémicos.

Los tests serológicos de Hemaglutinación Indirecta (HAI), Inmunofluorescéncia Indirecta (IFI) y ELISA (Enzyme Linked immunosorbent assay), llamados de pruebas convencionales, han sido los más utilizados en el tamizaje de donantes de sangre en los últimos 20 años (Figura 7). Un problema persistente ha sido el surgimiento de resultados indeterminados que muchas veces son difíciles de interpretar y acaban creando una situación delicada para la comunicación y el seguimiento de los donantes. Al mismo tiempo se evidenciaron resultados falsos negativos y falsos positivos en mayor proporción con las técnicas de HAI e IFI. El inconveniente de las pruebas de HAI y de IFI es que la lectura es visual, o sea, subjetiva y además no se adaptan a los procedimientos de automatización.  Al mismo tiempo, la sensibilidad y la especificidad de esos tests presentan variaciones  importantes de acuerdo con la  procedencia de los reactivos y  en el caso de la IFI, de los microscopios usados. De esa manera, la HAI y la IFI no son tests recomendados para el tamizaje serológico de donantes de sangre. La exclusión de esos tests en los procedimientos de tamizaje disminuye significativamente el número de resultados indeterminados observados. Los tests ELISA han mostrado sensibilidad variando entre 97,7% y 100% y especificidad entre 93,3% y 100%. Esos tests pueden ser automatizados y la lectura del resultado final se hace  por instrumentos, representando, junto con las técnicas de Quimioluminiscencia (CLIAs)  la mejor opción para el tamizaje en bancos de sangre. 




Durante muchos años  la mayoría de los tests ELISA utilizaban como fracciones antigénicas una mezcla de antígenos crudos del parásito (lisado). Con La introducción de las técnicas de biología molecular se pasaron a usar como fracciones antigénicas proteínas recombinantes o péptidos sintéticos correspondientes a los epítopos inmune dominantes del T.cruzi. Como  consecuencia  los tests diagnósticos se pudieron direccionar a regiones específicas que pudiesen mejorar la sensibilidad y la especificidad y al mismo tiempo permitieron producir kits diagnósticos sin las variaciones lote a lote que se observan con aquellos que utilizan fracciones antigénicas de lisado del parásito.  Actualmente existen en el mercado internacional, diversas alternativas para kits ELISA con antígenos lisado (Ag Lis) y con proteínas recombinantes (Ag rec).  

El uso de tests serológicos tipo ELISA o CLIA realmente han mejorado mucho el tamizaje para Chagas.  La sensibilidad de esos tests para detectar anticuerpos anti-T.cruzi está actualmente muy cerca del 100% y la especificidad entre el 98,5% y el 98,9%. Esos resultados dependen de las muestras estudiadas. En general para el cálculo de la sensibilidad se utilizan muestras positivas provenientes de diversos países, que no siempre pueden correlacionarse con personas realmente infectadas. Cuando existen dudas en los resultados de la evaluación de tests diagnósticos se acaban utilizando tests complementarios, que no siempre son totalmente confiables, como por ejemplo el RIPA y la IFI. Por una iniciativa de la OMS a partir de 2007 se están preparando sueros estandarizados que puedan ayudar a los productores de kits diagnósticos.

Para el cálculo de la especificidad, en general se aplica el test en el estudio de poblaciones de baja prevalencia, como por ejemplo en donantes de sangre.

Hasta hoy ningún test complementario ha sido aceptado universalmente como “gold standard” para el diagnóstico serológico de  la infección por T.cruzi, pero algunos ensayos de Western blot y de Inmuno blot pueden ayudar en la confirmación de resultados dudosos que se observan en el tamizaje de donantes de sangre. Recientemente se han realizado trabajos sobre el comportamiento de los inmuno ensayos frente a muestras leishmania y T.rangelli positivas y también frente a muestras de donantes proveniente de áreas con prevalencia para linajes I y II del T.cruzi con resultados importantes. Los tests ELISA Lis presentan mayor número de reacciones cruzadas con leishmania que los ELISA rec.  

En el tamizaje para la enfermedad de Chagas, las estrategias adoptadas en Latino América no son uniformes.  La OMS recomendaba desde 1991 la utilización de 2 tests, pero a partir de 2002 pasó a recomendar el uso de un solo test Inmunoenzimático de alta sensibilidad. En Brasil fueron obligatorios 2 tests hasta 2002 y después, hasta hoy, un solo test Inmunoenzimático de alta sensibilidad. En Argentina desde 2004 son obligatorios 2 tests para el tamizaje. En Costa Rica de 2005 a 2009 eran obligatorios 2 tests, uno con fracciones antigénicas recombinantes y otro con fracciones crudas del parásito. En otros países de Latinoamérica se utiliza uno o dos tests y en algunos países, según la OPS,  todavía no hay el 100% de cobertura para el tamizaje para Chagas. Considerando las discordancias entre los tests serológicos empleados en el tamizaje de donantes de sangre y que todavía no existe ningún test confirmatorio 100% seguro, la OMS recomienda que sean aplicados procedimientos estrictos de control de calidad (CC) en los laboratorios que realizan el tamizaje.


De cualquier manera, existen estudios en la literatura mostrando que el uso de un solo test tal vez no sea suficiente para el tamizaje eficaz de donantes para Chagas, por lo menos en algunas regiones de prevalencia más alta. En nuestra experiencia personal hemos observado muestras que son reactivas por un test ELISA recombinante y negativas por otro test ELISA (Lys) y viceversa. En nuestra opinión sería importante realizar un estudio multicéntrico y con la participación de varios países utilizando concomitantemente dos tests inmunoenzimáticos en el tamizaje, siendo uno con antígenos recombinantes (rec) y el otro con fracciones antigénicas del t.cruzi crudo (Lys). Después del análisis de los resultados se podría definir correctamente si para el tamizaje de Chagas es suficiente un único test o si son necesarios dos tests.
Pruebas no convencionales o tests rápidos no son pruebas ideales para el tamizaje de donantes pero en algunas situaciones especiales pueden ser usados, como por ejemplo para trabajos de campo, para el diagnóstico de niños que van a ser sometidos a tratamiento o como pre tamizaje en áreas de alta prevalencia (sin excluir el tamizaje tradicional posterior) para seleccionar donantes.

Para confirmar los resultados reactivos de los tests serológicos empleados en el tamizaje se pueden usar tests complementarios tipo TESA Western blot, Inmmunoblot o RIPA. En nuestra opinión utilizar solamente un test de IFI como confirmatorio puede ser muy arriesgado, debido a la baja especificidad del test.

En la figura 8 se pueden visualizar los tests serológicos disponibles para diagnóstico y tamizaje de la infección por T. cruzi.



Procedimientos de Control de Calidad

Los procedimientos de control de calidad en los laboratorios de tamizaje serológico han de ser estrictos y bien reglamentados. De modo general los aspectos más importantes del control de calidad son la evaluación de los kits antes de que hagan parte de la rutina, el uso de sueros control interno de baja reactividad en cada corrida,  para poder aceptar los resultados, el uso de paneles de sueros para aceptar los cambios de lotes de reactivos y la participación en por lo menos un programa de evaluación externa. 

Bibliografia recomendada
 










































 


































































  




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